陳偉泉，譚廣謀，黃文喜，黃海燕

(廣州醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院，廣州510095)

舌癌是一種較為常見的口腔頜面部惡性腫瘤，目前治療以手術(shù)(原發(fā)灶切除及頸部淋巴結(jié)清掃術(shù))為主，圍術(shù)期輔以放化療，但化療耐藥的出現(xiàn)嚴重制約了舌癌的臨床治療。細胞在營養(yǎng)剝奪或其他細胞應(yīng)激的刺激下可迅速產(chǎn)生大量自噬溶酶體，引發(fā)自噬潮、幫助細胞緩解應(yīng)激或促進細胞凋亡［1］。Beclin-1是參與哺乳動物自噬體形成的關(guān)鍵因子［2］，而自噬在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、遠端轉(zhuǎn)移及化療耐受中發(fā)揮重要作用［3～5］。本研究觀察了Beclin-1表達對舌癌細胞Tca8113順鉑敏感性的影響，以期為舌癌的臨床治療提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料 舌癌Tca8113細胞購自中國科學(xué)院上海細胞庫，接種于含10%新生牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基中，置于37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，至對數(shù)生長期后用于實驗;培養(yǎng)基RPMI1640、胰酶和新生牛血清購自Gibco公司，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購自TaKaRa公司，四唑化合物(MTS)購自Promega公司，順鉑、嘌呤霉素、氨基糖苷類抗生素G418購自Sigma公司，凝膠抽提試劑盒、無內(nèi)毒素質(zhì)粒抽提試劑盒Ⅰ購自廣州飛揚生物有限公司，BamHⅠ、MluⅠ和 HindⅢ限制性內(nèi)切酶、蛋白裂解液、蛋白酶抑制劑購自Fermentas公司。BCA蛋白濃度測定試劑盒購自Pierce公司，Beclin-1抗體、辣根過氧化物酶偶聯(lián)的羊抗兔IgG購自Santa Cruz公司;ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒購自Millipore公司;引物及干擾片段均由Invitrogen公司合成，其余試劑購自廣州威佳生物有限公司。

1.2 過表達和干擾Beclin-1真核載體的構(gòu)建 在NCBI上獲得Beclin-1(NM_003766.3)的序列，使用PP5軟件設(shè)計Beclin-1過表達的引物(名稱及序列略)，以Tca8113細胞cDNA為模板，PCR擴增得到Beclin-1片段。程序如下:94℃ 2 min，98℃ 10 s，68℃ 1 min，35個循環(huán);72℃ 2 min。瓊脂糖凝膠回收目的片段，并將其與真核表達載體pLEX-MCS分別用限制性內(nèi)切酶BamHⅠ和MluⅠ于37℃酶切3 h;瓊脂糖凝膠檢測酶切效果，回收酶切載體和DNA片段，T4 DNA ligase連接該DNA片段和載體，轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)DH5α，挑取單克隆送Invitrogen公司測序，鑒定陽性克隆。利用在線軟件BlockiTTM RNAi Designer設(shè)計Beclin-1的shRNA序列。在Invitrogen公司合成該干擾片段，95℃ 5 min退火(體系包括5× PCR Buffer 10 μL，上游shRNA序列20 μL，下游 shRNA 序列20 μL);BamH Ⅰ和 HindⅢ酶切載體 pRNAT-U6.1/neo，T4 DNA ligase連接退火片段和酶切后的載體，轉(zhuǎn)化DH5α，挑取單克隆測序，鑒定陽性克隆。RT-PCR和Western blotting法檢測重組載體對Beclin-1的干擾效果。

1.3 過表達和干擾Beclin-1的舌癌Tca8113細胞模型的建立 按照Endo-free plasmid mini kitⅠ試劑盒說明書操作，提取經(jīng)測序鑒定的陽性克隆中的質(zhì)粒，分別命名為pLEX-Beclin-1和pRNAT-Beclin-1-sh1、pRNAT-Beclin-1-sh2以及pRNAT-Beclin-1-sh3。瞬時轉(zhuǎn)染重組干擾質(zhì)粒于Tca8113細胞中，RT-PCR和Western blotting方法鑒定各干擾質(zhì)粒的沉默效果。將質(zhì)粒pLEX-MCS和pLEX-Beclin-1轉(zhuǎn)染Tca8113細胞，48 h后加入嘌呤霉素(1 g/mL)，逐漸提高嘌呤霉素質(zhì)量濃度，逐步篩選獲得穩(wěn)定過表達Beclin-1的細胞系Tca8113/Beclin-1及對照細胞系Tca8113/pLEXMCS。同時將pRNAT-U6.1/neo和沉默效果最好的干擾質(zhì)粒轉(zhuǎn)染Tca8113細胞，48 h后加入300 g/mL的G418，逐漸提高G418質(zhì)量濃度，逐步篩選獲得穩(wěn)定干擾Beclin-1的細胞系和對照細胞系。

1.4 順鉑干預(yù)及細胞存活率檢測 取上述對數(shù)生長期細胞，胰酶消化制成細胞懸液，調(diào)整細胞密度至3×104/mL，按100 μL/孔接種于 96 孔板中，37 ℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中過夜。每孔加入質(zhì)量濃度分別為0、1、2、4、8、16 mg/L 的順鉑100 μL(同時做6 個復(fù)孔)，72 h后每孔加入20 μL的MTS，37℃孵育2 h，多功能酶標儀檢測490 nm波長處的各孔吸光度A490，計算細胞存活率。實驗重復(fù)3次，取其結(jié)果的平均值。1.5 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS19.0進行統(tǒng)計學(xué)分析。計量資料以±s表示，兩組間比較采用t檢驗，多組間比較采用方差分析。P≤0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 過表達和干擾Beclin-1真核載體的構(gòu)建結(jié)果 成功構(gòu)建過表達Beclin-1的真核載體pLEX-Beclin-1及干擾Beclin-1的真核載體pRNAT-Beclin-1-sh1、pRNAT-Beclin-1-sh2 和 pRNAT-Beclin-1-sh3。RT-PCR顯示 pRNAT-Beclin-1-sh1、pRNAT-Beclin-1-sh2和pRNAT-Beclin-1-sh3在mRNA水平對Beclin-1的干擾效果分別達到 76.74%、58.21%和 56.53%(P均＜0.05)。Western blotting顯示干擾質(zhì)粒pRNAT-Beclin-1-sh1對Beclin-1的沉默效果最為明顯，見圖1。因此在后續(xù)的研究中僅使用質(zhì)粒pRNAT-Beclin-1-sh1沉默Beclin-1。

圖2 過表達和干擾Beclin-1的穩(wěn)定舌癌細胞模型

圖1 質(zhì)粒轉(zhuǎn)染Tca8113細胞48 h后Beclin-1蛋白表達

2.2 過表達和干擾Beclin-1舌癌細胞模型的建立結(jié)果 用嘌呤霉素篩選獲得穩(wěn)定過表達Beclin-1的細胞模型Tca8113/Beclin-1及對照組細胞模型Tca8113/pLEX-MCS。將 pRNAT-Beclin-1-sh1轉(zhuǎn)染入Tca8113，逐步用新霉素篩選獲得穩(wěn)定干擾Beclin-1的細胞模型Tca8113/pRNAT-Beclin-1-sh1及對照組細胞模型Tca8113/pRNAT-U6.1/neo。RT-PCR顯示Beclin-1基因在細胞Tca8113/Beclin-1中的表達量是對照細胞的23.49倍(表達量分別為23.49±1.053、1.00 ±0.003)，在細胞 Tca8113/pRNAT-Beclin-1-sh1中的表達量較對照細胞下調(diào)81.64%(表達量分別為 0.18 ±0.001、1.00 ±0.016)，P 均 ＜0.01;Western blotting所示Beclin-1表達變化同上，見圖2。

2.3 Tca8113對順鉑的敏感性 Tca8113/pLEXBeclin-1及對組細胞Tca8113/pLEX-MCS對順鉑的半數(shù)抑制濃度(IC50)值分別為(11.99±0.34)、(5.03 ±0.16)mg/L，P ＜0.01;而 Tca8113/pRNATBeclin-1-sh1及對照細胞Tca8113/pRNAT-U6.1/neo對順鉑的 IC50值分別為(2.76 ±0.09)、(5.01 ±0.18)mg/L，P ＜0.01。

3 討論

細胞受到外界刺激或者細胞周期發(fā)生改變時即可引發(fā)一種程序性細胞凋亡——自噬。自噬是指從粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的無核糖體附著區(qū)脫落的雙層膜包裹部分胞質(zhì)和細胞內(nèi)需降解的細胞器、蛋白質(zhì)等成分形成自噬體，并與溶酶體融合形成自噬溶酶體，降解其所包裹的內(nèi)容物，以實現(xiàn)細胞自身代謝和某些細胞器更新的需要［6］。越來越多的實驗證據(jù)表明，自噬與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)［7，8］。

Beclin-1位于染色體17q21，可與Ⅲ型磷脂酰肌醇-3激酶(PI3K)的催化亞單位Vps34結(jié)合形成復(fù)合體，介導(dǎo)其他自噬蛋白定位于前自噬小體，被認為是自噬信號的“守門人”。作為激活自噬的一個重要分子，Beclin-1自身的磷酸化水平和表達量決定自噬水平［9］。Jiang 等［10］發(fā)現(xiàn)，35 份頭頸部腺樣囊性癌組織中32份表達Beclin-1蛋白，其中高表達率為42.9%、低表達率為57.1%，且與患者存活率呈正相關(guān);Liang等［11］在89例頭頸部腺樣囊性癌組織中得到相同結(jié)論。在結(jié)腸癌細胞HCT116中，突變的Beclin-1無法被切割而不能引發(fā)自噬，可對抗化療藥物引起的細胞凋亡;在實體瘤中，Beclin-1突變能顯著降低腫瘤對化療的敏感性［12］。采用順鉑或者紫杉醇處理腫瘤細胞能夠激活細胞的自噬反應(yīng)，但卻使miR-30水平降低;上調(diào)miR-30表達后Beclin-1介導(dǎo)的自噬作用顯著下調(diào)，順鉑誘導(dǎo)的細胞凋亡顯著增強［13］。低濃度(10 nmol/L)雷帕霉素可導(dǎo)致大鼠胚胎成纖維細胞NIH3T3停滯在G1期而引發(fā)細胞凋亡，但異位表達Beclin-1后mTOR下游的信號通路可激活自噬，逆轉(zhuǎn)雷帕霉素引起的細胞凋亡［14］。本研究建立了穩(wěn)定過表達Beclin-1的舌癌細胞模型，且發(fā)現(xiàn)其對順鉑的敏感性較對照細胞顯著降低;建立了穩(wěn)定干擾Beclin-1的舌癌細胞模型，且其對順鉑的敏感性較對照細胞顯著增加。提示提高Beclin-1表達有助于增強舌癌細胞對順鉑的耐受性，下調(diào)Beclin-1表達可增加舌癌細胞對順鉑的敏感性。此為闡述Beclin-1調(diào)控舌癌化療敏感性的分子機制提供了理論基礎(chǔ)。

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