張麗娜，趙桂秋，林 紅，王 謙，牛膺筠

(青島大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院，山東青島266003)

以往的腫瘤血管生成理論認為，腫瘤直徑＞2 mm時需要激活血管內(nèi)皮細胞構(gòu)建血管叢、而獲取血供，否則腫瘤會因缺血缺氧而發(fā)生壞死。但Maniotis等［1］在1999年提出，經(jīng)典的“血管生成”可能不是所有腫瘤獲得微循環(huán)血液供應(yīng)的惟一途徑，具有高侵襲性和轉(zhuǎn)移性的惡性脈絡(luò)膜黑色素瘤細胞可以模擬內(nèi)皮細胞形成類似血管腔樣的通道，過程類似胚胎期血管形成，并將其命名為“血管生成擬態(tài)”(VM)。目前，國內(nèi)外學(xué)者已在多種惡性腫瘤及雙向分化腫瘤組織中發(fā)現(xiàn)VM，并通過電鏡、免疫組織化學(xué)及時相動態(tài)性核磁血管造影分析觀察到VM與腫瘤血管之間的血流連接，證實VM是腫瘤組織內(nèi)的功能性微循環(huán)［2～4］。2014年1月，我們對人視網(wǎng)膜母細胞瘤(RB)組織中的VM形成情況、來源及相關(guān)調(diào)控因子進行了檢測，旨在為進一步認識RB的微循環(huán)模式提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料 2007年1月～2013年12月青島大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院眼科病理室存檔的43份RB組織石蠟切片，其中未分化型25份、分化型18份，眼內(nèi)期11份、青光眼期17份、眼外期15份;一抗包括鼠抗人CD34單克隆抗體、鼠抗人ATP結(jié)合轉(zhuǎn)運蛋白G超家族成員2(ABCG2)單克隆抗體、鼠抗人造血干細胞抗原CD133(AC133)單克隆抗體、鼠抗人缺氧誘導(dǎo)因子1α(HIF-1α)單克隆抗體、兔抗人EphA2多克隆抗體、兔抗人基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)-2多克隆抗體(Santa Cruz公司)，二抗包括辣根過氧化酶標(biāo)記的羊抗鼠/兔二抗試劑盒(碧云天);DAB顯色試劑盒(碧云天);過碘酸-Schiff染色試劑盒(碧云天);Olympus光學(xué)顯微鏡(日本Olympus公司);恒溫水浴箱等。

1.2 RB組織中VM的檢測方法

1.2.1 HE染色 將RB組織石蠟切片置入二甲苯Ⅰ、Ⅱ中脫蠟各5 min;梯度乙醇脫蠟，每步1 min;自來水洗1 min，蒸餾水浸泡30 s，1%蘇木素染色5 min，自來水充分沖洗，1% 鹽酸乙醇溶液分化脫色15 s;自來水充分沖洗，1%氨水返藍30 s;自來水沖洗1 min，0.5%伊紅染色 30s，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片，顯微鏡下觀察。

1.2.2 過碘酸-Schiff/CD34(PAS/CD34)雙重染色將RB組織石蠟切片常規(guī)脫蠟至水，CD34免疫組織化學(xué)染色方法同上，至DAB顯色，自來水充分沖洗為止;蒸餾水浸泡1 min，1%過碘酸溶液浸泡5～10 min，蒸餾水充分沖洗，Schiff液浸泡10～15 min，0.5%偏重亞硫酸鈉溶液沖洗1～2 min×2次，蒸餾水沖洗10 min，蘇木素輕度復(fù)染，乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片，顯微鏡下觀察。以正常腎組織作為陽性對照。按照Folberg等［5］制定的PAS陽性模式標(biāo)準評價雙重染色結(jié)果。VM判斷標(biāo)準:無內(nèi)皮細胞襯復(fù)，腫瘤細胞圍成不規(guī)則管腔并襯復(fù)PAS陽性物質(zhì)，CD34染色陰性，管腔內(nèi)可見紅細胞，周圍無出血壞死和炎癥細胞浸潤。利用圖像處理軟件，隨機選擇10個高倍鏡視野，連續(xù)計數(shù)視野內(nèi)的VM，取其均值即為血管生成擬態(tài)密度(VMD)。

1.3 RB 組織中 ABCG2、AC133、CD34及 HIF-1α、E-phA2、MMP-2的檢測 采用免疫組織化學(xué)染色法。將RB組織石蠟切片常規(guī)脫蠟至水，3%H2O2去離子水室溫孵育5～10 min，PBS洗滌3 min×3次，微波抗原修復(fù);正常山羊血清封閉液室溫孵育20 min，傾去山羊血清封閉液;分別滴加鼠抗人CD34單克隆抗體(1∶200)、鼠抗人 ABCG2 單克隆抗體(1∶100)、鼠抗人AC133單克隆抗體(1∶100)、鼠抗人HIF-1α單克隆抗體(1∶200)、兔抗人 EphA2多克隆抗體(1∶300)、兔抗人 MMP-2 多克隆抗體(1∶300)，4 ℃濕盒過夜;PBS沖洗，3 min×3次;根據(jù)一抗分別滴加1∶500稀釋的辣根酶標(biāo)記的羊抗兔IgG或辣根酶標(biāo)記的羊抗鼠IgG，37℃孵育30 min;PBS沖洗，3 min×3次;DAB顯色，蘇木素輕度復(fù)染，乙醇梯度脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片，顯微鏡下觀察。用PBS代替一抗作為空白對照。ABCG2陽性為細胞膜呈黃色或棕黃色，AC133及CD34陽性為細胞質(zhì)呈黃色或棕黃色;HIF-1α陽性為胞核呈黃色或棕黃色，EphA2與MMP-2陽性均為胞質(zhì)呈黃色或棕黃色。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS19.0統(tǒng)計學(xué)軟件。正態(tài)分布的計量資料以±s表示，行方差分析及q檢驗;數(shù)據(jù)為非正態(tài)分布者用中位數(shù)表示，兩樣本間比較行Mann-Whitney非參數(shù)檢驗。計數(shù)資料行χ2檢驗;VMD與相關(guān)因子的關(guān)系采用Pearson相關(guān)分析。P≤0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 RB組織中VM檢測結(jié)果 HE染色顯示，部分RB組織中除有內(nèi)皮細胞襯覆的血管外，還可見腫瘤細胞圍成的不規(guī)則管腔，腔內(nèi)有紅細胞(圖1A)。PAS染色見櫻桃紅色的陽性血管樣圖案(網(wǎng)狀、分支狀)，且陽性物質(zhì)呈顆粒狀或團塊狀散布在腫瘤細胞胞質(zhì)內(nèi)，可見單個腫瘤細胞或幾個腫瘤細胞周圍有一層PAS陽性物質(zhì)環(huán)繞(圖1B)。PAS/CD34雙重染色可見兩者染色均陽性的內(nèi)皮細胞依賴性血管及PAS陽性、CD34陰性的VM(圖1C)。43份RB組織中VM 陽性 23例(53.48%)，VMD 為(26.52±8.72)個/HP。其中分化型和未分化型組織的VM陽性率分別為 22.22%(4/18)、76%(19/25)，P ＜0.01(χ2=12.165);眼內(nèi)期、青光眼期、眼外期組織的 VM 陽性率分別為 41.45%(6/11)、47.05%(8/17)、60%(9/15)，各期比較 P ＞0.05(χ2=0.543)。Pearson相關(guān)性分析顯示，VM陽性率與RB的分化程度呈負相關(guān)(r=-0.532，P ＜0.05)，與臨床分期無明顯相關(guān)。

圖1 三種染色方法所示VM(×100)

2.2 RB組織中ABCG2、AC133及CD34表達 VM陽性RB組織中可見部分腫瘤細胞ABCG2陽性表達，VM陰性組織中則少見ABCG2陽性表達，兩組織中ABCG2陽性細胞數(shù)分別為為(20.91±9.90)、(2.85±2.64)個/HP(陽性細胞多分布在內(nèi)皮依賴性血管或擬態(tài)血管周圍)，Mann-Whitney非參數(shù)檢驗顯示，U=-5.538，P ＜0.01。在作為對照的正常視網(wǎng)膜組織中，CD34在血管內(nèi)皮細胞中表達陽性，AC133未見表達;VM陽性組織中部分腫瘤細胞AC133表達陽性(圖2B)，VM陰性組織中未見AC133表達;所有RB組織中僅血管內(nèi)皮細胞CD34陽性表達(圖2C)。

圖2 免疫組織化學(xué)染色(×200)所示ABCG2、AC133及CD34表達

2.3 RB 組織中 HIF-1α、EphA2、MMP-2 的表達及與VMD的相關(guān)性 HIF-1α、EphA2、MMP-2在 VM陽性組織中的表達分別為 58.12 ±6.79、108.49 ±8.54、93.93 ±6.19，在 VM 陰性組織中分別為 8.95±3.76、43.94 ±5.44、22.13 ±5.48，兩兩比較，P 均＜0.01(t分別為 28.70、29.01、39.95)。Pearson 相關(guān)性分析顯示，VMD與HIF-1α、EphA2及MMP-2表達均呈正相關(guān)(r分別為 0.694、0.630、0.795，P 均＜0.01)。

3 討論

VM是指某些高度惡性腫瘤細胞通過自身變形模擬血管內(nèi)皮細胞并與細胞外基質(zhì)相互作用模仿血管壁結(jié)構(gòu)形成可以運輸血液(血漿，紅細胞)的管道系統(tǒng)，進而重塑腫瘤微循環(huán)，并與宿主血管相連使腫瘤獲得血液供應(yīng)的一種現(xiàn)象［1］。VM概念的提出是對傳統(tǒng)“內(nèi)皮依賴性血管是腫瘤微循環(huán)的惟一方式”這一觀點的挑戰(zhàn)，也是腫瘤血管生成及血液供應(yīng)理論的重要補充，并將對腫瘤的預(yù)防、診斷和治療策略產(chǎn)生重大影響。目前，VM的生成機制尚不明確，其與內(nèi)皮依賴性血管的本質(zhì)區(qū)別為無內(nèi)皮細胞的襯覆［5］，僅是腫瘤細胞圍成的管腔。在VM形成過程中，部分腫瘤細胞要通過自身變形并模擬內(nèi)皮細胞的功能成為有運輸能力的管道;由于缺乏內(nèi)皮細胞，VM管壁上的腫瘤細胞容易脫落入其管道中，進入血管向遠處轉(zhuǎn)移。因此，VM與腫瘤的高度侵襲性和不良預(yù)后有明顯相關(guān)性;VM僅在低分化的惡性腫瘤中存在，說明腫瘤細胞的這種變形及表現(xiàn)內(nèi)皮細胞特性的能力與其分化程度有關(guān)。本研究結(jié)果顯示，23例RB組織發(fā)現(xiàn)VM存在，其中未分化型組織陽性率顯著高于分化型組織，而不同臨床分期組織間比較陽性率無顯著差異。提示VM主要在低分化的 RB中存在，而與腫瘤的分期無明顯相關(guān)性［6，7］。

腫瘤細胞出現(xiàn)多潛能胚胎細胞表型和多種與內(nèi)皮/血管表型有關(guān)的基因表型可能是其發(fā)生模擬血管變形的重要分子基礎(chǔ)。目前認為，構(gòu)成VM管壁的腫瘤細胞來源于腫瘤中具有多向分化潛能的干細胞，這些腫瘤干細胞向內(nèi)皮細胞方向分化是形成VM的基礎(chǔ)。Elena等［8］認為，腫瘤的血管化包括新生血管形成、recruitment、VM、馬賽克血管等多種模式，其原因可能是腫瘤中存在干細胞亞群。ABCG2是ATP結(jié)合轉(zhuǎn)運體超家族中的G2家族成員，最早發(fā)現(xiàn)在造血干細胞中高表達，目前已被當(dāng)作最常用的腫瘤干細胞表面標(biāo)志物［9］。本研究發(fā)現(xiàn)，VM陽性RB組織中ABCG2陽性細胞數(shù)顯著多于VM陰性組織，且陽性細胞多分布在內(nèi)皮依賴性血管或擬態(tài)血管周圍。提示ABCG2陽性的腫瘤干細胞在VM形成中可能扮演重要角色，并可能是構(gòu)成VM管壁的主要細胞來源。腫瘤細胞可表達其他類型細胞的特異性基因(尤其是內(nèi)皮細胞特異性基因)，此可能為其通過自身變形模擬內(nèi)皮細胞形成PAS陽性管道狀結(jié)構(gòu)能力的機制之一［10］。AC133是內(nèi)皮祖細胞及前體細胞的特異表達基因，在成熟內(nèi)皮細胞中不表達;CD34則相反，是一種分化成熟的內(nèi)皮細胞特異性標(biāo)志［11］。本研究顯示，VM陽性RB組織中可見部分腫瘤細胞AC133陽性表達，未見CD34表達;而腫瘤組織中血管內(nèi)皮細胞未見AC133表達，CD34表達陽性。提示構(gòu)成VM管壁的內(nèi)皮樣腫瘤細胞更有可能是來源于腫瘤干細胞。CD34在腫瘤細胞中的表達尚無統(tǒng)一意見。目前鑒定VM最常用的辦法是PAS/CD34雙重染色，CD34染色陽性的血管通常被認定為內(nèi)皮依賴性血管，而構(gòu)成VM的腫瘤細胞CD34表達陰性［12］;亦有學(xué)者發(fā)現(xiàn)構(gòu)成VM的腫瘤細胞可表達CD34［13］。本研究未發(fā)現(xiàn)表達CD34的腫瘤細胞的可能原因為腫瘤干細胞逐漸向內(nèi)皮樣細胞分化的過程類似胚胎時期血管的生成，早期腫瘤干細胞分化為內(nèi)皮祖細胞及前體細胞，具有了部分內(nèi)皮細胞的功能但形態(tài)上更像腫瘤細胞(故而形成VM);在特定的刺激下這些腫瘤干細胞繼續(xù)向內(nèi)皮細胞方向分化，開始表達成熟內(nèi)皮細胞的特異基因同時形態(tài)上也更像內(nèi)皮細胞，這時往往被認定為內(nèi)皮依賴性血管。

腫瘤局部微環(huán)境對VM的形成具有重要調(diào)控作用，其中缺氧及細胞外基質(zhì)成分的改變被認為是誘導(dǎo)VM形成的始動因素。HIF-1為異性缺氧狀態(tài)下發(fā)揮活性的轉(zhuǎn)錄因子，是由對氧敏感的α亞基和穩(wěn)定表達的β亞基組成的異源二聚體［14］，其生物效應(yīng)是由α亞基實現(xiàn)的。在低氧環(huán)境下，HIF-1α參與多種基因的表達，是維持細胞內(nèi)氧穩(wěn)態(tài)的關(guān)鍵因子，與腫瘤細胞對缺氧的耐受密切相關(guān)［15］，并通過調(diào)控多種下游信號分子的表達在VM形成中發(fā)揮關(guān)鍵作用，但分子機制目前尚不完全清楚。此外，MMP亦可通過降解細胞外基質(zhì)成分促進腫瘤侵襲、浸潤，為VM形成提供必要空間基礎(chǔ)并參與其基質(zhì)重塑;MMP在低分化RB組織中表達明顯增高［16］。EphA2是一種受體蛋白酪氨酸激酶，在侵襲性強的腫瘤細胞中高表達［17］，其磷酸化可使GTP酶Racl和Cdc42的構(gòu)象發(fā)生變化、失活，而這兩種酶是三維培養(yǎng)形成管腔樣結(jié)構(gòu)所必須的;敲除EphA2表達可導(dǎo)致細胞不能形成血管樣結(jié)構(gòu)。MMP-2、EphA2的高表達可能與缺氧有關(guān)［18］。本研究顯示，VM陽性RB組織中HIF-1α、E-phA2及MMP-2表達均明顯高于VM陰性組織，且三者表達均與VMD呈正相關(guān)。提示HIF-1α、EphA2及MMP-2在VM的形成中發(fā)揮重要作用。

綜上所述，低分化RB組織中存在VM，其管壁構(gòu)成可能主要來源于ABCG2陽性的腫瘤干細胞，HIF-1α及其下游因子EphA2、MMP-2表達上調(diào)可能促進VM形成。

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