楊文杰，向云濤，程建輝，張向紅，馬繁榮，王愛紅

(延安大學醫(yī)學院，陜西延安716000)

乳漿大戟為多年生草本，是國產(chǎn)大戟屬植物中分布最廣、變異幅度最大的種之一。乳漿大戟全草入藥，具拔毒止癢、利尿消腫之效，但國內(nèi)外鮮見乳漿大戟抗腫瘤的報道。我們用乳漿大戟提取物作用于體外培養(yǎng)的人肺癌A549細胞，觀察其抗腫瘤活性，為進一步開發(fā)利用乳漿大戟提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 細胞株和主要試劑 人肺癌細胞A549由延安大學醫(yī)學實驗中心實驗室保存。噻唑藍(MTT)、碘化丙錠(PI)、二甲基亞砜(DMSO，Sigma-Aldrich公司，美國);RPMI1640培養(yǎng)基(Invitrogen公司，美國)，四季青新生小牛血清(浙江天杭生物科技有限公司)，胰酶(Gibco BRL公司，美國)，熒光倒置顯微鏡及CCD采用Nikon顯微鏡，流式細胞儀 FACS Calibur(Becton Dickinson公司，美國)，酶標儀采用美國Bio-Rad 680型全自動酶標儀。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng) 人肺癌細胞A549用RPMI1640培養(yǎng)基培養(yǎng)，常規(guī)加入10%小牛血清，100 U/mL青霉素，0.1 mg/mL鏈霉素。置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.2.2 乳漿大戟提取物制備 乳漿大戟地上全草陰干，用植物搗碎機粉碎，加適量純水制成混懸液，粗濾紙過濾收集濾液，低溫風干稱重，加純水配制成100 g/L，0.22 μm濾器過濾保存于-20℃?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 乳漿大戟提取物對A549細胞增殖的影響

采用MTT法檢測。取對數(shù)生長期的A549細胞，以5×104/mL密度接種于96孔板，每孔200 μL。次日細胞貼壁后，更換培養(yǎng)基，對照組未加乳漿大戟提取物，實驗組添加乳漿大戟提取物，其終質(zhì)量濃度為 0.2、0.4、0.8 g/L，每個濃度設(shè) 6 個復孔，于培養(yǎng)24、48、72 h 加入 MTT 20 μL/孔(5 mg/mL)，繼續(xù)孵育4 h，吸棄培養(yǎng)液，加入 DMSO 150 μL/孔，充分混勻，在酶標儀490 nm處測其吸光度(A)值。按照公式計算細胞增殖抑制率:抑制率=［1-(實驗組A值/對照組A值)］×100%。實驗重復3次。

1.2.4 乳漿大戟提取物對A549細胞形態(tài)的影響

采用PI染色法。取對數(shù)生長期的A549細胞，以2×105/mL的密度接種于6孔板中，每孔2 mL。次日細胞貼壁后，更換培養(yǎng)基，對照組未加乳漿大戟提取物，實驗組添加乳漿大戟提取物，其終質(zhì)量濃度為0.2、0.4、0.8 g/L，培養(yǎng)48 h 后棄去培養(yǎng)基，2 mL 的PBS液洗2次，加入50 g/L的PI染料，避光染色30 min，棄上清，在熒光顯微鏡下觀察細胞核的形態(tài)改變。

1.2.5 乳漿大戟提取物對A549細胞凋亡的影響采用流式細胞儀檢測。流式細胞術(shù)樣品的準備:①藥物處理細胞(方法同1.2.4)后，收集細胞(1～5)×106/mL，500～1 000 r/min離心5 min，棄去培養(yǎng)液。②3 mL的PBS液洗1次。③離心去PBS液，加入冰預冷的70%乙醇固定，4℃，1 h。④離心去固定液，3 mL PBS液重懸5 min。⑤400目篩網(wǎng)過濾1次，500～1 000 r/min離心5 min，棄去PBS液。⑥用1 mL的PI染液染色，4℃避光30 min。⑦流式細胞儀檢測細胞凋亡率。

1.2.6 統(tǒng)計學方法 采用 SPSS17.0統(tǒng)計軟件。計量資料以±s表示，組間比較用成單因素方差分析。P≤0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 乳漿大戟提取物對A549細胞的增殖抑制率結(jié)果見表1。

表1 乳漿大戟提取物對A549細胞的增殖抑制率(%，±s)

表1 乳漿大戟提取物對A549細胞的增殖抑制率(%，±s)

注:與0.2 g/L 比較，△P ＜0.05;與0.4 g/L 比較，#P ＜0.05

乳漿大戟提取物(g/L)細胞增殖抑制率24 h 48 h 72 h 0.2 9.3 ±3.5 37.8 ±3.5 27.1 ±6.5 0.4 13.8 ±8.3△ 41.9 ±2.6△ 45.2 ±1.6△0.8 19.2 ±3.9△# 46.3 ±3.2△# 43.1 ±2.8△#

2.2 各組A549細胞形態(tài)變化 對照組A549細胞飽滿呈梭形，胞質(zhì)豐富，大小均一，單層貼壁生長，細胞核呈完整橢圓形，細胞數(shù)目多，幾乎無凋亡細胞。實驗組細胞隨濃度增加，細胞數(shù)目減少，細胞體積變小、變圓，細胞核出現(xiàn)固縮，呈致密強熒光。0.8 g/L實驗組的細胞減少，細胞間隙增大，貼壁狀態(tài)差，細胞變圓，細胞膜皺縮，折光性小，細胞脫落明顯，見圖1(A為對照組，B為0.8 g/L乳漿大戟實驗組)。

圖1 乳漿大戟提取物作用A549細胞48 h細胞形態(tài)變化(×100)

2.3 各組A549細胞凋亡率比較 對照組細胞凋亡率為5.33% ± 0.67%，實驗組 0.2、0.4、0.8 g/L乳漿大載提取物作用后細胞凋亡率分別是15.53%±0.15%、21.42% ±1.01%、46.57% ± 1.76%，實驗組與對照組比較，P均＜0.05。

3 討論

上世紀五六十年代西方醫(yī)學化學合成藥物達鼎盛時期，但從七十年代以來，人們發(fā)現(xiàn)化學合成藥物具有毒副作用大的缺陷，而天然藥物具有毒副作用小的優(yōu)點，開發(fā)成本低［1～3］。從天然產(chǎn)物中尋找保健預防和治療疾病的有效成分成為國際潮流，天然藥物今后將會逐漸成為醫(yī)藥市場的主流［4～6］。

肺癌是世界上發(fā)病率和病死率最高的惡性腫瘤之一［7］。化療是治療腫瘤的主要手段之一，但化療常常帶來多系統(tǒng)的不良反應。天然藥物具有有效成分多、結(jié)構(gòu)多樣、抗癌譜廣、毒副作用小等特點，已成為開發(fā)抗腫瘤藥物的新途徑。我們課題組采集乳漿大戟的地上全草，提取水溶性組分，經(jīng)過濾除菌后，作用于體外培養(yǎng)的人肺癌細胞A549，結(jié)果顯示，乳漿大戟提取物能抑制A549細胞的增殖，最大抑制率是46.3%。

近年來，通過中草藥誘導細胞凋亡治療惡性腫瘤已成為研究的熱點之一［8～11］。藥物除通過各自的靶點直接作用外，也可以通過誘導細胞凋亡殺傷腫瘤細胞。因此，能否誘導腫瘤細胞凋亡已成為篩選抗癌藥物的標準之一［12］。細胞凋亡是一個復雜的生理和病理過程，其信號轉(zhuǎn)導途徑主要有兩條，即線粒體途徑和死亡受體途徑。不同的誘因可通過相同的信號轉(zhuǎn)導途徑誘發(fā)細胞凋亡，不同的信號轉(zhuǎn)導途徑不是孤立發(fā)揮作用，而是緊密聯(lián)系、相互作用，整個信號轉(zhuǎn)導系統(tǒng)為復雜的網(wǎng)絡(luò)狀調(diào)控結(jié)構(gòu)。本實驗結(jié)果顯示，乳漿大戟提取物處理后的A549細胞出現(xiàn)凋亡細胞的形態(tài)特征;流式細胞檢測結(jié)果顯示乳漿大戟提取物可以誘導A549細胞凋亡，但誘導細胞凋亡的機制需要進一步研究。

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