李興旺，趙艷玲

(溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院育英兒童醫(yī)院，浙江溫州325027)

睪丸支持細(xì)胞位于曲細(xì)精管內(nèi)基底膜附近，不僅為生精細(xì)胞的持續(xù)發(fā)育和分化提供結(jié)構(gòu)上的支持和營養(yǎng)的供給，而且形成了一種非常重要的生理結(jié)構(gòu)——血睪屏障，從而確保精子發(fā)生的順利進(jìn)行［1，2］。血睪屏障的構(gòu)成和功能受到精密調(diào)控。如Occludin蛋白是一種緊密連接膜蛋白［3］，其磷酸化參與調(diào)節(jié)了精母細(xì)胞穿過血睪屏障過程中屏障功能的變化［4，5］?？滤_奇病毒—腺病毒受體(CAR)屬于免疫球蛋白超家族，是廣泛存在于上皮和內(nèi)皮組織的一種緊密連接跨膜蛋白［6～8］。在大鼠生精上皮，CAR表達(dá)于支持細(xì)胞和處于遷移過程中的生精細(xì)胞［6，9］，但其生理作用目前尚不明了。本研究采用體外血睪屏障模型(支持細(xì)胞上皮屏障模型)，觀察CAR小干擾RNA(si RNA)對支持細(xì)胞上皮屏障通透性的影響，并探討其機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 主要試劑及儀器 DMEM/F12培養(yǎng)基、胰蛋白酶、表皮生長因子(EGF)、大豆胰蛋白酶抑制劑、Ⅱ型膠原酶、透明質(zhì)酸酶S-Ⅰ型、DNA酶Ⅰ購自美國Sigma公司;24孔細(xì)胞培養(yǎng)板由美國Corning公司提供;MillicellOR-PCF型插入小室(膜面積為0.6 cm2)和MillicellOR-ERS(electrical resistance system)購自美國Millipore公司。單克隆兔抗Occludin抗體和FITC-山羊抗兔IgG分別購自美國Zymed Laboratories公司和英國Abcam公司。BX53熒光顯微鏡購自日本Olympus公司;Macprobe 5.1處理軟件。凝膠成像系統(tǒng)購自美國Bio Rad公司;siRNA購自美國Ambion公司。

1.2 體外血睪屏障模型制備及分組 采用睪丸支持細(xì)胞原代雙室培養(yǎng)方法［10，11］制備睪丸支持細(xì)胞上皮屏障，即體外血睪屏障模型。大鼠睪丸原代支持細(xì)胞經(jīng)分離、接種、培養(yǎng)、純化、鑒定而獲得。將制備好的支持細(xì)胞混懸液按照每毫升2.5×106(按膜面積計(jì)算為1.67×106/cm2)細(xì)胞密度接種于雙室模型的插入小室內(nèi)。培養(yǎng)條件為5%CO2、35℃恒溫恒濕培養(yǎng)。將細(xì)胞分為CAR siRNA組、對照組。CAR siRNA組細(xì)胞培養(yǎng)3 d后，采用100 nmol/L的CAR siRNA(5'-CCUGAACAGAGGAUCGAAATT-3')和RiboJuice siRNA轉(zhuǎn)染試劑進(jìn)行轉(zhuǎn)染24 h;對照組采用100 nmol/L無同源性非靶向雙鏈RNA及RiboJuice siRNA轉(zhuǎn)染試劑進(jìn)行轉(zhuǎn)染。兩組均按照說明書嚴(yán)格操作。

1.3 支持細(xì)胞中CAR mRNA檢測 采用RT-PCR法。轉(zhuǎn)染后第2天，收集細(xì)胞，按照TRIzol試劑盒說明書抽提細(xì)胞總RNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA，以此cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。CAR基因的上游引物5'-CGCTCCTACTGTGCTTC-3'，下游引物 5'-CTTTCTGGTTATCGGACGG-3'。內(nèi)參基因 S-16的上游引物5'-TCCGCTGCAGTCCGTTCAAGTCTT-3'，5'-GCCAAACTTCTTGGTTTCGCAGCG-3'。PCR產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳，之后經(jīng)凝膠成像系統(tǒng)成像分析。

1.4 睪丸支持細(xì)胞中CAR、Occludin蛋白檢測 采用蛋白印跡法。轉(zhuǎn)染結(jié)束后第2天，收集細(xì)胞，提取兩組細(xì)胞總蛋白。蛋白經(jīng)定量后，進(jìn)行12%十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳，之后通過電轉(zhuǎn)膜法將蛋白轉(zhuǎn)至硝酸纖維素膜上，封閉1 h后，加入相應(yīng)的一抗(CAR、Occludin)及二抗，孵育反應(yīng)、洗膜、ECL曝光、顯影、洗片、拍照。以GAPDH為內(nèi)參照，目的蛋白相對含量以目的蛋白灰度值與GAPDH灰度值的比值表示。

1.5 跨上皮電阻(TER)測定 大鼠睪丸支持細(xì)胞原代雙室培養(yǎng)模型建立后，采用Millicell-ERS電阻系統(tǒng)測量雙室模型內(nèi)外室的電位差。具體方法參照J(rèn)anecki等［11］的研究報(bào)道。TER值的計(jì)算公式:TER=(測定值-空白本底值)/膜的有效生長面積。

1.6 睪丸支持細(xì)胞的Occludin蛋白檢測及分布觀察 參照文獻(xiàn)［12］方法，采用免疫熒光細(xì)胞化學(xué)染色法檢測Occludin蛋白。從插入小室中吸出培養(yǎng)液，PBS(含 1 mmol/L CaCl2，1 mmol/L MgCl2)潤洗2次，去除殘留的培養(yǎng)液;加入足量含2.5%多聚甲醛的PBS，室溫下孵育15 min，吸去多聚甲醛;加入含50 mmol/L NH4Cl的PBS，充分洗去剩余甲醛;加入含0.5%Triton的PBS，進(jìn)行細(xì)胞膜打孔，室溫下放置10 min;PBS潤洗后，加入1%BSA室溫下封閉30 min;加入50 μL 1～2 μg/mL單克隆兔抗 Occludin抗體，37℃放置30 min，PBS潤洗;加入FITC-山羊抗兔IgG抗體，37℃放置30 min，PBS潤洗3～4次，晾干后，在熒光顯微鏡觀察Occludin分布情況。

1.7 睪丸支持細(xì)胞中與早期內(nèi)涵體抗原1(EEA1)抗體結(jié)合的Occludin蛋白檢測 將2 μg正常兔IgG加入含有300 μg蛋白的支持細(xì)胞裂解液，孵育1 h;然后加入10 μL蛋白A/G瓊脂糖珠，孵育1 h，4℃離心后取上清液。在上清液中加入2 μg正常兔IgG(陰性對照)或EEA1抗體，室溫過夜。然后加入20 μL蛋白A/G瓊脂糖珠，孵育1 h。糖珠—抗原抗體復(fù)合物經(jīng)裂解液洗滌，在SDS-PAGE加樣緩沖液中100℃煮沸5 min，離心吸取上清液。Western blotting法檢測免疫沉淀后特異性結(jié)合的Occludin蛋白量。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量數(shù)據(jù)以±s表示，組間比較采用t檢驗(yàn)或秩和檢驗(yàn)。P≤0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

CAR siRNA組與對照組CAR mRNA相對表達(dá)量分別為 0.122 ±0.013、0.429 ±0.039，CAR 蛋白相對表達(dá)量分別為 0.142 ±0.041、0.532 ±0.022，兩組比較，P均＜0.05。睪丸支持細(xì)胞的TER在轉(zhuǎn)染前3 d逐漸升高;3 d后穩(wěn)定。轉(zhuǎn)染結(jié)束后第2天CAR siRNA組與對照組TER分別為(37±2.5)、(50±3.0)ohm·cm2，轉(zhuǎn)染后第 3 天分別為(38 ±2.4)、(47 ±2.9)ohm·cm2，兩組比較，P ＜0.05。見圖1。

圖1 睪丸支持細(xì)胞培養(yǎng)不同時(shí)間點(diǎn)TER的變化

CAR siRNA組與對照組Occludin蛋白相對表達(dá)量分別為 0.164 ±0.025、0.143 ±0.031，兩組比較，P＞0.05。對照組細(xì)胞Occludin呈蜂巢樣沿細(xì)胞膜線狀分布;而CAR siRNA組分布較紊亂，細(xì)胞膜處減少，線性分布破壞，在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)增多(圖2)。與EEA1結(jié)合的Occludin蛋白量CAR siRNA組、對照組分別為 1.332 ±0.018、1.000 ±0.015，兩組比較，P ＜0.05。

圖2 兩組睪丸支持細(xì)胞Occludin表達(dá)

3 討論

血睪屏障是機(jī)體最有效的保護(hù)屏障之一，可阻止某些大分子物質(zhì)經(jīng)血液或淋巴途徑進(jìn)入曲細(xì)精管管腔，能調(diào)節(jié)生物活性物質(zhì)在生精上皮內(nèi)的濃度，同時(shí)具有免疫屏障作用，創(chuàng)造穩(wěn)定生精內(nèi)環(huán)境［2］。本實(shí)驗(yàn)培養(yǎng)的原代支持細(xì)胞之間逐漸形成屏障，電子顯微鏡下觀察到血睪屏障的緊密連接、基底細(xì)胞外質(zhì)特化、間隙連接和橋粒等超微結(jié)構(gòu)，因此支持細(xì)胞上皮屏障模型是體外常用的模擬血睪屏障模型［10，11］。

TER由離子經(jīng)細(xì)胞旁間隙流動(dòng)形成，是檢測細(xì)胞旁通透性的常用指標(biāo)，可以反映支持細(xì)胞上皮屏障的通透性(完整性)［13］。對照組細(xì)胞在培養(yǎng)過程中，TER值逐漸升高，波峰形成于培養(yǎng)后3～4 d(屏障形成)，然后在4～7 d維持穩(wěn)定的TER值，同Lie等［9］的研究結(jié)果一致。

CAR作為柯薩奇病毒和腺病毒的特異受體，是Ⅰ型跨膜糖蛋白，因其在病毒感染宿主細(xì)胞過程中的重要介導(dǎo)作用而被廣泛研究。在病毒攻擊宿主細(xì)胞過程中，病毒纖維蛋白突競爭性地抑制宿主細(xì)胞之間原有的CAR-CAR連接，代之以病毒-CAR連接，從而破壞原有的連接復(fù)合體，病毒得以穿越上皮?，F(xiàn)有研究提示CAR在不同組織的分布不同，且作用多樣，需進(jìn)一步闡明。在生精上皮周期第八階段，生精細(xì)胞穿過血睪屏障的行為非常類似柯薩奇病毒和腺病毒侵染宿主細(xì)胞的行為，因此生精細(xì)胞很可能采用同種“策略”穿越血睪屏障，即支持細(xì)胞—生精細(xì)胞之間的CAR-CAR連接，競爭性地取代了血睪屏障處原有的支持細(xì)胞間的CAR-CAR連接，從而使生精細(xì)胞通過血睪屏障進(jìn)入生精上皮頂部微環(huán)境進(jìn)一步發(fā)育成熟［14］。本研究結(jié)果顯示，CAR siRNA組CAR mRNA、蛋白含量較對照組顯著降低，表明siRNA有效干擾了目的基因表達(dá)。CAR沉默使TER降低，提示通透性增強(qiáng)，屏障功能降低，表明CAR表達(dá)變化的確可以改變支持細(xì)胞上皮的完整性，影響血睪屏障的功能，支持了上述推測。

本研究同時(shí)觀察了CAR基因?qū)χС旨?xì)胞中Occludin蛋白表達(dá)和分布的影響。在血睪屏障，Occludin是構(gòu)成緊密連接的重要組分之一，其功能的發(fā)揮與表達(dá)量及分布密切相關(guān)［4，5］。Western blotting分析顯示，CAR干擾后Occludin表達(dá)量沒有變化，但其分布發(fā)生改變。免疫熒光染色結(jié)果顯示，正常時(shí)Occludin分布于細(xì)胞膜、細(xì)胞間連接處，呈線性;而CAR siRNA組Occludin分布較紊亂，細(xì)胞膜處減少，線性分布破壞，由細(xì)胞間連接處向細(xì)胞質(zhì)內(nèi)移增多。另外，已知EEA1是一內(nèi)吞膜泡相關(guān)蛋白，是內(nèi)涵體的標(biāo)志物［15］。CAR siRNA組中與 EEA1結(jié)合的Occludin量升高，表明Occludin向細(xì)胞質(zhì)內(nèi)移增多是通過內(nèi)吞增加引起的。以上結(jié)果提示，CAR沉默后引起支持細(xì)胞屏障通透性改變，至少部分是誘導(dǎo)Occludin蛋白內(nèi)吞增強(qiáng)而分布改變的結(jié)果，表明CAR不只是血睪屏障的結(jié)構(gòu)分子，而且對其他分子表達(dá)和功能等方面有調(diào)控作用。有研究表明，Occludin內(nèi)吞與其磷酸化變化有關(guān)，可能CAR降低表達(dá)后導(dǎo)致磷酸酶活性改變，然后使Occludin磷酸化改變，最終導(dǎo)致Occludin分布改變;而參與的磷酸酶可能是非受體酪氨酸激酶c-Src，因?yàn)樵谘G屏障該酶與CAR可形成蛋白復(fù)合物［4］，這需進(jìn)一步研究。

研究證實(shí)，血睪屏障對于生精上皮處精子發(fā)育至關(guān)重要。例如，血睪屏障在生精上皮周期的第Ⅷ至第Ⅸ階段要經(jīng)歷大量的“打開—閉合”拆解和重建等完整性變化，以使前細(xì)線期生精細(xì)胞通過屏障進(jìn)入頂部進(jìn)一步發(fā)育。因此，如果能發(fā)現(xiàn)參與這一特定過程的靶分子，通過對靶分子的調(diào)控從而控制血睪屏障“開而不閉”或“閉而不開”，那么最終可干擾精子發(fā)生。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示，CAR是與睪丸支持細(xì)胞上皮屏障調(diào)控密切相關(guān)的分子，因此，它是開發(fā)避孕藥及探索不孕不育癥機(jī)制的潛在靶點(diǎn)。

綜上所述，CAR siRNA能增加睪丸支持細(xì)胞上皮屏障通透性，其機(jī)制可能與CAR誘導(dǎo)Occludin蛋白內(nèi)吞增強(qiáng)而分布改變有關(guān)。

［1］Lui WY，Cheng CY.Transcriptional regulation of cell adhesion at the blood-testis barrier and spermatogenesis in the testis［J］.Adv Exp Med Biol，2012，763:281-294.

［2］Mok KW，Mruk DD，Cheng CY.Regulation of blood-testis barrier(BTB)dynamics during spermatogenesis via the"Yin"and"Yang"effects of mammalian target of rapamycin complex 1(mTORC1)and mTORC2［J］.Int Rev Cell Mol Biol，2013，301:291-358.

［3］馬騰，王萍，薛一雪.RhoA參與緩激肽調(diào)節(jié)緊密連接相關(guān)蛋白o(hù)ccludin分布和表達(dá)的作用［J］.山東醫(yī)藥，2011，51(25):28-29.

［4］Su L，Mruk DD，Lui WY，et al.P-glycoprotein regulates bloodtestis barrier dynamics via its effects on the occludin/zonula occludens 1(ZO-1)protein complex mediated by focal adhesion kinase(FAK)［J］.Proc Natl Acad Sci U S A，2011，108(49):19623-19628.

［5］Pérez CV，Sobarzo CM，Jacobo PV，et al.Loss of occludin expression and impairment of blood-testis barrier permeability in rats with autoimmune orchitis:effect of interleukin 6 on Sertoli cell tight junctions［J］.Biol Reprod，2012，87(5):122.

［6］Mirza M，Petersen C，Nordqvist K，et al.Coxsackievirus and adenovirus receptor is up-regulated in migratory germ cells during passage of the blood-testis barrier［J］.Endocrinology，2007，148(11):5459-5469.

［7］Venkatraman G，Behrens M，Pyrski M，et al.Expression of Coxsackie-Adenovirus receptor(CAR)in the developing mouse olfactory system［J］.J Neurocytol，2005，34(3-5):295-305.

［8］Vigl B，Zgraggen C，Rehman N，et al.Coxsackie-and adenovirus receptor(CAR)is expressed in lymphatic vessels in human skin and affects lymphatic endothelial cell function in vitro［J］.Exp Cell Res，2009，315(2):336-347.

［9］Lie PP，Cheng CY，Mruk DD.Crosstalk between desmoglein-2/desmocollin-2/Src kinase and coxsackie and adenovirus receptor/ZO-1 protein complexes，regulates blood-testis barrier dynamics［J］.Int J Biochem Cell Biol，2010，42(6):975-986.

［10］ Mruk DD，Cheng CY.An in vitro system to study Sertoli cell blood-testis barrier dynamics［J］.Methods Mol Biol，2011，763:237-252.

［11］Janecki A，Jakubowiak A，Steinberger A.Regulation of transepithelial electrical resistance in two-compartment Sertoli cell cultures:in vitro model of the blood-testis barrier［J］.Endocrinology，1991，29(3):1489-1496.

［12］劉玉霞，李學(xué)仲，李冬梅，等.胎腦神經(jīng)干細(xì)胞的培養(yǎng)及鑒定［J］.山東醫(yī)藥，2007，47(22):24-25.

［13］Chen J，F(xiàn)ok KL，Chen H，et al.Cryptorchidism-induced CFTR down-regulation results in disruption of testicular tight junctions through up-regulation of NF-κB/COX-2/PGE2［J］.Hum Reprod，2012，27(9):2585-2597.

［14］Wang CQ，Cheng CY.A seamless trespass:germ cell migration across the seminiferous epithelium during spermatogenesis［J］.J Cell Biol，2007，178(4):549-556.

［15］Chua CE，Tang BL.Engagement of the small GTPase Rab31 protein and its effector，early endosome antigen 1，is important for trafficking of the ligand-bound epidermal growth factor receptor from the early to the late endosome［J］.J Biol Chem，2014，289(18):12375-12389.