曹明芳 ，林 翔 ，程 良

（1.福建中醫(yī)藥大學附屬人民醫(yī)院眼科，福建福州 350004； 2.福建中醫(yī)藥大學附屬人民醫(yī)院骨傷科，福建福州 350004；3.福建中醫(yī)藥大學，福建福州 350122）

血管內(nèi)皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）和血管內(nèi)皮生長因子受體2（vascular endothelial growth factor receptor 2，VEGF-R2） 是糖尿病性視網(wǎng)膜病變（diabetic retinopathy，DR）發(fā)生發(fā)展過程中的重要細胞因子和受體。本研究采用鏈脲佐菌素（streptozotocin，STZ）腹腔注射法建立了糖尿病（DR）動物模型，觀察了VEGF、VEGF-R2在實驗動物視網(wǎng)膜中的表達，現(xiàn)將實驗結(jié)果報道如下。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗動物 20只8w齡敘利亞金黃地鼠，購自北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司；體重180g～200g。

1.1.2 試劑與儀器 2%STZ溶液：預先滅菌，使用前臨時配制，配制后0.5h內(nèi)注射完畢；血糖儀：德國拜耳公司快速血糖儀；顯微鏡：日本Olympus IX51；VEGF檢測試劑盒：美國santa cruz biotechnology，inc；VEGF-R2檢測試劑盒：英國abcam公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 分組與造模 敘利亞金黃地鼠20只，隨機分為正常對照組和模型組，每組10只。

模型組適應性喂養(yǎng)1w后，禁食12h，按50mg/kg的用量腹腔內(nèi)注射2%STZ，連續(xù)3d；72h后取尾靜脈血測血糖，第5天時重復檢測血糖，確定糖尿病動物模型造模成功（血糖高于13.5mmol/L即算成功）。每2周測血糖、體重，視血糖維持狀態(tài)決定是否進行2次造模。正常對照組適應性喂養(yǎng)1w后，予腹腔注射等體積檸檬酸鈉-檸檬酸緩沖液，檢測血糖、稱重。2組均于造模16w后，處死動物取標本，每只動物均選取右眼，經(jīng)4%多聚甲醛固定后行VEGF、VEGF-R2染色。

1.2.2 VEGF、VEGF-R2檢測方法 標本取材后置于4%多聚甲醛溶液固定，石蠟包埋，連續(xù)切片。采用免疫組化SP法，按試劑盒說明書步驟進行，所有切片染色均采用相同條件，每批染色均設陽性對照、陰性對照。陽性對照用已知染色陽性的組織切片，陰性對照以PBS代替一抗孵育組織切片。

1.3 統(tǒng)計學方法

采用SPSS17.0統(tǒng)計軟件分析，兩組間比較用t檢驗，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 VEGF檢測結(jié)果

VEGF主要位于視網(wǎng)膜內(nèi)核層、神經(jīng)節(jié)細胞層及Müller細胞。組織切片中顯示淡黃色至棕黃色顆粒為陽性細胞標志。正常對照組基本沒有VEGF陽性表達，模型組所有動物VEGF陽性表達明顯多于正常對照組，視網(wǎng)膜外界膜、外核層、外叢狀層、內(nèi)核層、內(nèi)叢狀層及神經(jīng)節(jié)細胞層均出現(xiàn)極強的棕色染色，染色的程度較正常對照組明顯增強，面積明顯增大。結(jié)果見表1和圖1。

表1 2組視網(wǎng)膜VEGF染色結(jié)果比較 （±s）

表1 2組視網(wǎng)膜VEGF染色結(jié)果比較 （±s）

注：與正常對照組比較，1）P<0.01

組別 n 平均光密度 面積正常對照組 10 0.000±0.000 0.000±0.000模型組 10 33.511±11.4071） 192.251±46.3811）

圖1 敘利亞金黃地鼠視網(wǎng)膜VEGF染色

2.2 VEGF-R2檢測結(jié)果

VEGF-R2主要位于視網(wǎng)膜內(nèi)核層、神經(jīng)節(jié)細胞層及Müller細胞。組織切片中顯示淡黃色至棕黃色顆粒為陽性細胞標志，正常對照組基本沒有VEGFR2的陽性表達，模型組所有動物VEGF-R2陽性表達明顯多于正常對照組，視網(wǎng)膜外界膜、外核層、外叢狀層、內(nèi)核層、內(nèi)叢狀層及神經(jīng)節(jié)細胞層均出現(xiàn)極強的棕色染色，染色的程度較正常對照組明顯增強，面積明顯增大，結(jié)果見表2和圖2。

表2 2組視網(wǎng)膜VEGF-R2染色結(jié)果比較 （±s）

表2 2組視網(wǎng)膜VEGF-R2染色結(jié)果比較 （±s）

注：與正常對照組比較，1）P<0.01

組別 n 平均光密度 面積正常對照組 10 0.000±0.000 0.000±0.000模型組 10 0.210±0.0281） 108.980±34.8941）

圖2 敘利亞金黃地鼠視網(wǎng)膜VEGF-R2染色

3 討 論

DR的發(fā)病機制與VEGF及其受體VEGF-R2密切相關(guān)。首先，VEGF是導致視網(wǎng)膜新生血管生成的主要原因，其次它還具有破壞血-視網(wǎng)膜屏障、增加血管滲漏的作用，第三，它還可增加內(nèi)皮細胞對葡萄糖的轉(zhuǎn)運，使細胞內(nèi)的葡萄糖增加，導致血管并發(fā)癥。在VEGF的3個受體中，VEGF-R2在DR的發(fā)病中起著重要作用。研究表明，在1w糖尿病鼠視網(wǎng)膜VEGF mRNA水平是正常對照組的3.2倍，視網(wǎng)膜血管通透性增加是正常對照組的1.8倍［1-3］。從本實驗結(jié)果可知，正常敘利亞金黃地鼠視網(wǎng)膜免疫組化染色中VEGF和VEGF-R2基本無表達，表明正常大鼠視網(wǎng)膜VEGF和VEGF-R2含量極低；而模型組敘利亞金黃地鼠視網(wǎng)膜免疫組化染色中VEGF和VEGF-R2呈強表達，且陽性表達主要位于視網(wǎng)膜外界膜、外核層、外叢狀層、內(nèi)核層、內(nèi)叢狀層及神經(jīng)節(jié)細胞層。這些改變均與人類糖尿病及糖尿病性視網(wǎng)膜病變的表現(xiàn)十分相似，故考慮該模型可作為研究人類糖尿病微血管并發(fā)癥之DR發(fā)生、發(fā)展機制的重要途徑。

［1］宋鄂，徐琪，王心蕊，等.血管內(nèi)皮生長因子在糖尿病大鼠視網(wǎng)膜中的表達［J］.吉林大學學報：醫(yī)學版，2003，29（1）：38.

［2］Frank R N，Amin R H，Eliott D，et al.Basic fibroblast growth factor and vascular endothelial growth factor are present in epiretinal and choroidal neovascular membranes［J］.Am J Ophthalmol，1996，122（3）：393.

［3］Gilbert R E，Vranes D，Berka J L，et al.Vascular endothelial growth factor and its receptors in control and diabetic rat eyes［J］.Lab Invest，1998，78（8）：1017-1027.