龔一萍，沈煒毅

（浙江中醫(yī)藥大學，浙江杭州 310053）

急性心肌缺血最常見的原因是由于冠狀動脈粥樣硬化導致冠狀動脈管腔狹窄或閉塞，以及在狹窄的基礎上發(fā)生冠狀動脈痙攣而出現急性或慢性心肌供血不足［1］?，F代研究證實，益氣活血中藥可以促進梗死區(qū)血管新生，抑制心肌梗死后心肌細胞凋亡和心室重構，改善心功能［2-3］。在前期的臨床驗證中顯示，自擬復脈湯能明顯改善氣虛血瘀型冠心病患者胸悶胸痛、氣短乏力等癥狀，心電圖ST-T改變有效率在90%以上。由于復脈湯抗心肌缺血的作用機制尚不清楚，故本研究擬觀察復脈湯對實驗性心肌缺血大鼠肌鈣蛋白及心肌超微結構的影響，探討其抗心肌缺血的作用機制。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗動物 SD大鼠（雄性）58只，生產許可證號：（2008001638685），體重 290g～300g，由上海西普爾必凱實驗動物有限公司提供。飼養(yǎng)條件：飼養(yǎng)于浙江中醫(yī)藥大學實驗動物中心，清潔飼養(yǎng)室保持恒溫（20℃），相對濕度40%～60%。

1.1.2 實驗藥物 單味中藥均由浙江中醫(yī)藥大學中醫(yī)門診部提供。復脈湯（主要由炙黃芪20g，生曬參10g，麥冬 12g，五味子 6g，丹參 15g，川芎 10g，紅花10g，紅景天10g，雞血藤30g等組成）加水煎煮2次（第1次1.5h，第2次0.5h），制備成生藥，濃度為3.75g/mL；炙甘草湯（炙甘草、生姜、桂枝、黨參、生地黃、阿膠、麥冬、麻子仁、大棗）水煎濃縮至2g/mL，放入4℃冰箱；酒石酸美托洛爾（50mg/片，批號：H32025390）由阿斯利康制藥有限公司提供。

1.1.3 試劑與儀器 3%戊巴比妥鈉（美國Sigma，Sigma-P3761），大鼠肌鈣蛋白I（cTnⅠ）ELISA檢測試劑盒（杭州誠維生物科技有限公司，批號：E2014042103）。小動物呼吸機（上海奧爾科特生物科技有限公司ALc-V9），小動物多道生理記錄儀（法國 ekma），離心機（AllegraX-15R），日立7020全自動生化分析儀（0500790S），冷凍高速離心機（Thermo），多功能酶標儀（Thermo），生化培養(yǎng)箱，萊卡UC7超薄切片機（0902332S），透射電子顯微鏡（日立H-7650）。

1.2 實驗方法

1.2.1 分組與給藥 58只大鼠按隨機數字表法分為7組，即復脈湯高、中、低劑量組，模型組、炙甘草湯組、酒石酸美托洛爾組（美托洛爾組）、假手術組。除模型組10只外，其余各組每組8只。假手術組及模型組給予等體積生理鹽水；復脈湯高劑量組（37.5g/kg）、復脈湯中劑量組（18.75g/kg）、復脈湯低劑量組（9.375g/kg）、炙甘草湯組（20g/kg）、美托洛爾組（10mg/kg）每天給予相應藥物灌胃1次，共計2w。

1.2.2 模型制備 除假手術組外參考文獻［4］方法稍做改動制備模型。具體步驟為：以3%戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉，仰臥固定，頸部與胸部皮膚去毛，常規(guī)消毒、鋪巾。逐層分離皮膚、肌肉，暴露氣管，開胸前氣管插管，連接動物呼吸機行人工呼吸。四肢皮下連接心電圖電極，記錄Ⅱ導聯心電圖。在胸骨左側3、4肋骨處切開皮膚，逐層鈍性分離皮下組織、肌肉，用開瞼器撐開胸腔，剝離心包膜，暴露心臟，在左心耳與肺動脈圓錐間，左心耳下方約2mm，用0/6號縫合針，進針深度控制在0.1cm左右，結扎冠狀動脈左前降支。結扎后迅速清除胸腔內多余血液，觀察心電圖變化，以心電圖ST段立即抬高及結扎線以下心肌顏色蒼白為造模成功。假手術組只穿線不結扎，其余步驟相同。

1.2.3 檢測指標 實驗結束后各組大鼠腹主動脈取血，3000r/min離心20min，分離血清，采用ELISA法檢測血清中肌鈣蛋白Ⅰ的濃度。在預先包被肌鈣蛋白Ⅰ抗體的包被微孔中，依次加入標本、標準品、HRP標記的檢測抗體，溫育并徹底洗滌。用底物3，3′，5，5′—四甲基聯苯胺（Tetramethyi benzidine，TMB）顯色，TMB在過氧化物酶的催化下轉化成藍色，并在酸的作用下最終轉化成黃色。顏色的深淺和樣品中的肌鈣蛋白Ⅰ含量呈正相關。用酶標儀在450nm波長下測定吸光度（OD值），計算樣品濃度。

1.2.4 心肌組織的電鏡觀察 取左前壁心尖上方5mm處心肌組織，立即投入預冷的2.5%戊二醛中固定，經PBS漂洗3次，四氧化鋨固定后，用乙醇溶液（50%、70%、80%、90%、95%）梯度脫水，丙酮包埋滲透，加熱聚合，超薄切片修塊，用透射電鏡在12000倍下觀察各組心肌組織超微結構的變化。

1.3 統(tǒng)計學方法

2 結 果

2.1 復脈湯對急性心肌梗死大鼠血清cTnⅠ濃度的影響

左前降支結扎成功率為100%，在手術中模型組死亡2只，炙甘草湯組死亡1只，余均存活至實驗結束。各組大鼠血清cTnⅠ濃度檢測結果，見表1。

表1 復脈湯對急性心肌梗死大鼠血清cTnⅠ濃度的影響 （±s）

表1 復脈湯對急性心肌梗死大鼠血清cTnⅠ濃度的影響 （±s）

注：與模型組比較，1）P<0.01；與炙甘草湯組比較，2）P<0.05，3）P<0.01

組別 n cTnⅠ（pg/mL）假手術組 8 322.68±15.431）模型組 8 511.51±29.81復脈湯高劑量組 8 426.76±37.371）3）復脈湯中劑量組 8 449.55±31.301）2）復脈湯低劑量組 8 460.43±37.651）炙甘草湯組 7 489.99±49.59美托洛爾組 8 430.52±30.811）3）

由表1可知，假手術組血清cTnⅠ濃度顯著低于模型組（P<0.01）；與模型組比較，復脈湯各劑量組、美托洛爾組大鼠血清cTnⅠ濃度顯著降低，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.01）；與炙甘草湯組比較，復脈湯中、高劑量組、美托洛爾組血清cTnⅠ濃度降低，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05，P<0.01）；復脈湯各劑量組與美托洛爾組比較差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。

2.2 對心肌缺血大鼠心肌超微結構的影響

各組大鼠心肌組織的電鏡觀察，結果見圖1。模型組：心肌細胞Z線清晰可見，明暗帶清楚可辨，肌原纖維斷裂、扭曲、縮短，肌絲束間線粒體明顯增多，排列紊亂，體積增大，嵴突破壞、斷裂、溶解，空泡形成。假手術組：心肌細胞Z線尚規(guī)則，肌小節(jié)清晰，肌絲排列規(guī)則、整齊，線粒體在肌絲束排列成單排，線粒體嵴完整。復脈湯高劑量組：心肌細胞Z線清楚，肌原纖維基本規(guī)則，局部心肌纖維破壞溶解，線粒體基本完好，在肌絲束間多成單排，嵴突無破壞。復脈湯中劑量組：肌原纖維排列基本規(guī)則，局部心肌纖維有溶解滲出，較高劑量組明顯，線粒體基本完好，嵴突無破壞，少量線粒體進入破壞溶解區(qū)。復脈湯低劑量組：心肌纖維排列基本整齊，Z線明顯，線粒體形態(tài)不規(guī)則，部分心肌纖維斷裂，扭曲變形。炙甘草湯組：Z線明顯，明暗帶清楚，心肌纖維排列欠規(guī)則，部分肌小節(jié)斷裂，出現收縮帶，閏盤結構輕度破壞，線粒體排列不規(guī)則，線粒體嵴突破壞、斷裂、溶解，空泡形成。美托洛爾組：肌原纖維排列尚規(guī)則，少量纖維斷裂溶解，局部滲出，線粒體結構基本正常。

圖1 各組心肌組織電鏡結果

3 討論

當冠脈的供血與心肌的需血之間發(fā)生矛盾，冠脈血流量不能滿足心肌代謝的需要時，就會引起心肌缺血缺氧。急劇的、暫時的缺血缺氧可引起心絞痛，而持續(xù)的、嚴重的心肌缺血可引起心肌壞死及心肌梗死。心肌梗死病死率較高，占心臟病死亡率的50%～70%。如何防治心肌缺血，有重大的臨床意義。實驗中觀察的肌鈣蛋白Ⅰ（Cardiac TroponInⅠ，cTnⅠ）僅存在于心肌收縮蛋白的細肌絲上，調節(jié)肌肉的收縮與舒張。在心肌細胞缺血損傷的早期，即可引起血清cTnⅠ水平顯著升高。觀察cTnⅠ的變化，可以了解心肌缺血的損傷程度［5］。因此cTnⅠ可作為心肌缺血、損傷、壞死及急性冠脈綜合征的敏感指標，心肌細胞缺血受損越嚴重，外周血清中肌鈣蛋白Ⅰ含量越高。實驗結果顯示：復脈湯高、中、低劑量組cTnⅠ的濃度與模型組比較差異有統(tǒng)計學意義（P<0.01），說明復脈湯對急性心肌缺血的保護作用可能與降低外周血cTnⅠ的濃度有關，且復脈湯對心肌缺血的保護作用呈劑量依賴性。

本研究中復脈湯為臨床自擬方，以益氣活血化瘀立法，治以益氣治本為主，活血通絡治標為次，氣行則血行，血行則無瘀，氣血通暢，則心神得寧，故病霍然而愈?，F代研究證實，益氣活血中藥具有良好的抗心肌缺血作用。李龍等［6］臨床研究發(fā)現益氣活血化瘀法能明顯改善中醫(yī)辨證屬氣虛血瘀型冠心病患者的心絞痛癥狀以及心電圖缺血程度。手術結扎冠狀動脈左前降支損傷心氣，心氣虛乏，無力推動血行，血脈瘀滯，故而出現氣虛血瘀的狀態(tài)。重用黃芪以助心氣，并與生曬參相須為用，增強補益心氣、推動血行的功效。結扎冠脈，血流受阻，加重血瘀的形成，丹參、紅花活血養(yǎng)血，可擴張冠脈，改善冠心病血液流變學。川芎為血中之氣藥，雞血藤活血養(yǎng)血通絡，有助于血脈的通利，減輕心肌細胞的缺氧損傷。美托洛爾為β受體阻滯劑，能夠減慢心率，降低心肌耗氧，減輕心肌缺血損傷，降低外周血cTnⅠ濃度。實驗研究發(fā)現，復脈湯各劑量組與美托洛爾組之間血清cTnⅠ濃度比較差異無統(tǒng)計學意義。

心肌缺血同時還表現為心肌組織超微結構的損害，主要表現為肌原纖維結構排列紊亂、斷裂、溶解、短縮以及線粒體結構破壞。正常的心肌細胞，肌原纖維是心肌細胞的最小單元體，線粒體結構破壞是細胞損害的最敏感指標。復脈湯各劑量組與美托洛爾組冠脈結扎所致的心肌超微結構損害明顯減輕，肌原纖維排列基本有序，線粒體結構完整。

綜上所述，復脈湯改善心肌缺血的機制可能與降低缺血心肌細胞cTnⅠ的釋放、減輕心肌超微結構的損害有關。

［1］陳灝珠.實用內科學［M］.12版.北京：人民衛(wèi)生出版社，2005：1237.

［2］衣慧.益氣活血方影響心肌梗死后血管新生與成熟的HIF-1α信號機制研究［D］.西安：第四軍醫(yī)大學，2013.

［3］章燕，戴小華.益氣活血中藥改善急性心肌梗死后左心室重構實驗研究進展［J］.安徽中醫(yī)學院學報，2012，31（2）：74-76.

［4］周文武，劉玲，陳軍，等.冠狀結扎法制作大鼠心肌缺血模型［J］.中國實驗動物學，2004，12（4）：226-230.

［5］武建國，顧可梁，童明慶，等.醫(yī)學實驗診斷學進展［M］.南京：東南大學出版社，2000：228-229.

［6］李龍，李紅彥，遇昕，等.益氣活血化瘀法治療冠心病心絞痛30例［J］.中國中醫(yī)藥現代遠程教育，2010，8（2）：22-23.