馮納婷，馮雅碧

創(chuàng)傷性腦損傷 （traumatic brain injury，TBI）是神經(jīng)外科最常見的疾病之一，局部組織的炎癥反應(yīng)是繼發(fā)性腦損傷的重要因素［1］。研究表明，血管內(nèi)皮表面的細(xì)胞間黏附分子 （ICAM－1）可以引起顱腦損傷后腦組織病理生理改變，大量中性粒細(xì)胞聚集和黏附于腦血管內(nèi)皮并浸潤到損傷腦組織中［2，3］；核因子－κB （nuclear factor－kappa B，NF－κB） 調(diào)控 B淋巴細(xì)胞免疫球蛋白κ輕鏈的基因轉(zhuǎn)錄，與機(jī)體的炎癥過程密切相關(guān)［3，4］。葛根素是一種天然多酚類化合物，結(jié)構(gòu)類似雌二醇，具有某些雌激素樣作用。研究發(fā)現(xiàn)它是一種天然的抗氧化劑，可以清除各種氧自由基和抑制脂質(zhì)過氧化，保護(hù)細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)，從而具有抗氧化、降血壓、抗癌等多種藥理活性，目前研究表明它對(duì)大鼠創(chuàng)傷性腦損傷具有一定的保護(hù)作用［5］。本試驗(yàn)即通過建立大鼠顱腦損傷模型，給予葛根素治療后，運(yùn)用分子生物學(xué)手段，分析腦組織中ICAM－1和NF－κB表達(dá)的變化，初步探討葛根素保護(hù)顱腦損傷后的分子機(jī)制，為葛根素的進(jìn)一步研究和應(yīng)用提供理論基礎(chǔ)和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料 丙二醛 （MDA） 和超氧化物歧化酶（SOD）試劑盒購自南京建成生物工程研究所。葛根素購自中國藥品生物制品檢定所，純度＞98%。ICAM－1和 NF－κB 抗體購自 sigma公司；dNTP和TagDNA聚合酶購自Promega公司。成年健康SD大鼠15只，由第四軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。

1.2 方法

1.2.1 動(dòng)物模型建立 建立大鼠顱腦損傷動(dòng)物模型［6］，隨機(jī)分為假手術(shù)組、模型組和治療組，每組各5只。腹腔注射4%戊巴比妥鈉，沿中線左側(cè)切開頭皮，分離骨膜，保持完整硬膜，從高處撞擊硬膜，造成顱腦損傷。假手術(shù)組僅打開顱骨，不致腦損傷。模型組大鼠，給予生理鹽水處理；治療組大鼠，建立模型前預(yù)先口服灌胃50 μmol/L的葛根素7 d。

1.2.2 測(cè)定MDA含量和SOD活性 按試劑盒操作說明，通過TBA硫代巴比妥酸法測(cè)定MDA含量，黃嘌呤氧化酶法測(cè)SOD活性。

1.2.3 RT－PCR 實(shí)驗(yàn) 收集各組大鼠腦組織，TRIZOL法提取細(xì)胞總mRNA。按照基因BANK序列設(shè)計(jì)合成引物（大連寶生物公司合成）。ICAM－1上游引物序列，5＇－GGTGGGCAAGAACCTCATCCT－3＇；下游引物序列，5＇－CTGGCGGCT CAGTGTCTCATT－3＇。NF－κB基因序列設(shè)計(jì)引物，由大連寶生物公司合成：5＇－TCAATGGCTACACAGGACCA －3＇；5＇－CACTGTCAC CTGGAACCAGA－3＇。β－actin 序列：5＇－ATCATGTT TGAGACCTTCAACA－3＇； 反義 5＇－CAT CTCTTGCT CGAAGTCCA－3＇。 RT－PCR 分析 ICAM－1 和 NF－κB mRNA 表達(dá)的變化：5 μl PCR 產(chǎn)物，加1 μl的loading buffer混勻，加入樣品孔內(nèi)，電壓為5 V/cm，電泳 30 min，終止電泳。 0.5%溴化乙啶（EB）染色，凝膠成像儀觀察圖像并計(jì)算灰度值。

1.2.4 Western blot實(shí)驗(yàn) 收集各組大鼠腦組織，加入1 ml胞裂解緩沖液，機(jī)械勻漿，12000 r/min，離心30 min，收集上清。取各組蛋白樣品進(jìn)行SDSPAGE凝膠電泳，轉(zhuǎn)膜，5%的脫脂乳封閉非特異性染色，加 ICAM－1 和 NF－κB 一抗（1∶1000），孵育后加過氧化物酶標(biāo)記的二抗，顯色，觀察結(jié)果。

2 結(jié) 果

2.1 各組SOD活性及MDA含量 表1結(jié)果顯示，與假手術(shù)組比較，模型組大鼠，SOD活性顯著降低（P＜0.05），MDA 含量顯著增加（P＜0.05），提示模型組動(dòng)物顱腦損傷明顯；經(jīng)葛根素處理的治療組大鼠，可以顯著增加腦組織中SOD的活性，并降低MDA的含量。

表1 各組SOD活性及MDA含量（±s）

表1 各組SOD活性及MDA含量（±s）

注：與假手組相比，＊P＜0.05；與模型組相比，＃P＜0.05

SOD（NU /mg） MDA（μmol/g）61.46±2.39 2.31±0.21 33.18±1.42＊ 4.64±0.11＊51.36±1.31＃ 2.93±0.3＃分組 n假手術(shù)組 5模型組 5治療組 5

2.2 葛根素對(duì)ICAM－1和NF－κB表達(dá)的影響RT－PCR結(jié)果顯示，與假手術(shù)組相比，模型組大鼠腦組織中 ICAM－1和 NF－κB mRNA表達(dá)顯著升高（P＜0.05，n＝5），經(jīng)葛根素處理的治療組大鼠，與模型組大鼠相比較，腦組織中 ICAM－1和 NF－κB mRNA 表達(dá)顯著降低（P＜0.05，n＝5），結(jié)果見圖 1。

圖1 RT－PCR檢測(cè)ICAM－1和NF－κB的表達(dá)

Western blot結(jié)果顯示，與假手術(shù)組相比，模型組大鼠腦組織中ICAM－1和NF－κB蛋白表達(dá)顯著升高（P＜0.05，n＝5），經(jīng)葛根素處理的治療組大鼠，與模型組大鼠相比較，腦組織中ICAM－1和NF－κB蛋白表達(dá)顯著降低（P＜0.05，n＝5），結(jié)果見圖 2。

圖2 Western blot檢測(cè)ICAM－1和NF－κB的表達(dá)

3 討 論

葛根素是一種多酚類化合物，屬植物雌激素類，具有很強(qiáng)的抗氧化活性。葛根素在4位和7位各有1個(gè)羥基，可與雌激素受體（ER）相結(jié)合，具有抗自由基損傷、擴(kuò)張心血管、降低心肌耗氧、改善心肌代謝、抑制血小板活化與聚集等作用［7］。細(xì)胞間黏附因子－1（ICAM－1）廣泛分布于中樞神經(jīng)系統(tǒng)中，分為跨膜和可溶性蛋白兩種形式，可介導(dǎo)多種炎癥細(xì)胞黏附于血管內(nèi)皮細(xì)胞，是多種炎性因子發(fā)揮作用的分子基礎(chǔ)［8，9］。 轉(zhuǎn)錄因子 NF－κB 主要存在于細(xì)胞質(zhì)中，炎癥介質(zhì)、氧化應(yīng)激等刺激可激活NF－κB信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，暴露NF－κB的DNA結(jié)合位點(diǎn)，發(fā)生核轉(zhuǎn)位，與細(xì)胞因子、黏附分子等的啟動(dòng)子或增強(qiáng)子的特異性位點(diǎn)結(jié)合，啟動(dòng)基因轉(zhuǎn)錄的過程［10，11］。創(chuàng)傷性腦損傷后，局部組織易發(fā)生炎癥反應(yīng)，引起繼發(fā)性腦損傷。如何降低或減弱炎癥反應(yīng)，避免繼發(fā)性腦損傷的發(fā)生，保護(hù)受損的腦組織，降低高致殘率、病死率，是目前臨床研究中亟待解決的問題。

本研究中，通過建立大鼠顱腦損傷動(dòng)物模型，經(jīng)葛根素預(yù)處理后，分別觀察各組大鼠腦組織中SOD活性及MDA含量的變化，結(jié)果提示，與假手術(shù)組比較，模型組大鼠SOD活性顯著降低，MDA含量顯著增加（P＜0.05），而經(jīng)葛根素處理的大鼠，可以顯著增加腦組織中SOD的活性，并降低MDA的含量。RT－PCR和Western blot實(shí)驗(yàn)分別觀察葛根素對(duì)ICAM－1和NF－κB mRNA及蛋白表達(dá)的影響，結(jié)果均顯示，與假手術(shù)組相比，模型組大鼠腦組織中ICAM－1和NF－κB蛋白表達(dá)顯著升高，經(jīng)葛根素處理后，大鼠腦組織中NF－κB蛋白表達(dá)顯著降低。以上結(jié)果均提示，大鼠顱腦受到損傷后，局部組織炎癥反應(yīng)顯著，炎癥相關(guān)指標(biāo)均發(fā)生明顯的變化，而經(jīng)葛根素預(yù)處理的大鼠，可以抑制或降低顱腦受到損傷后腦組織中局部炎癥反應(yīng)，調(diào)控或影響ICAM－1和NF－κB分子的信號(hào)通路，起到腦保護(hù)的效應(yīng)。

本實(shí)驗(yàn)以多酚類化合物葛根素為研究對(duì)象，通過建立大鼠顱腦損傷動(dòng)物模型，利用RT－PCR和Western blot等手段，分析和檢測(cè)大鼠腦組織中血管內(nèi)皮表面的細(xì)胞間黏附分子－1（ICAM－1）和NF－κB的變化，初步探討葛根素影響顱腦損傷后相關(guān)因子表達(dá)的作用機(jī)制，為葛根素的進(jìn)一步研究和應(yīng)用提供理論基礎(chǔ)和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

［1］ Chen G， Shi JX， Hang CH.Inhibitory effect on cerebral inflammatory agents that accompany traumatic brain injury in a rat model：a potential neuroprotective mechanism of recombinant human erythropoietin（rhEPO）［J］.Neurosci Lett，2007，425（3）：177－82.

［2］ Briassoulis G，Papassotiriou I，Mavrikiou M.Longitudinal course and clinical significance of TGF－beta1， sL－ and sE－selectins and sICAM－1 levels during severe acute stress in children［J］.Clin Biochem，2007，40（5－6）：299－304.

［3］ Jin W， Wang H， Yan W.Disruption of Nrf2 enhances upregulation ofnuclearfactor－kappaB activity，proinflammatory cytokines，and intercellular adhesion molecule－1 in the brain after traumatic brain injury［J］.Mediators Inflamm，2008，72（5）：174.

［4］ Baldwin AS Jr.The NF－kappa B and I kappa B proteins：new discoveries and insights［J］.Ann Rev Immunol， 1996，14（6）：649.

［5］ Boue SM，Wiese TE，Nehls S，et al.Evaluation of the estrogenic effects of legume extracts containing phytoestrogens［J］.J Agric Food Chem，2003，51（8）：2193－9.

［6］ Wong DY，Krebsbach PH，Hollister SJ.Brain cortex regeneration affected by scaffold architectures［J］.J Neurosurg，2008，109（4）：715－22.

［7］ Chen G，Zhang J，Jiannong Y.Determination of puerarin，daidzein and rutin in Pueraria lobata（Wild） Ohwi by capillary electrophoresis with electrochemical detection［J］.J Chromatogr A，2001，923（1－2）：255－62.

［8］ Hofer S，Bopp C，Hoerner C，et al.Injury of the blood brain barrier and up－regulation of icam－1 in polymicrobial sepsis［J］.J Surg Res，2008，146（2）：276－81.

［9］ Nordal RA，Wong CS.Intercellular adhesion molecule－1 and blood－spinal cord barrier disruption in central nervous system radiation injury［J］.J Neuropathol Exp Neurol，2004，63（5）：474－83.

［10］ Marion S，Mazzolini J，Herit F，et al.The NF－κB signaling protein Bcl10 regulates actin dynamics by controlling AP1 and OCRL－bearing vesicles［J］.Dev Cell，2012，23（5）：954－67.

［11］ Oh J，Kim SH，Ahn S，Lee CE.Suppressors of cytokine signaling promote Fas－induced apoptosis through downregulation of NF－κB and mitochondrial Bfl－1 in leukemic T cells［J］.J Immunol，2012，189（12）：5561－71.