劉 宸，章宏偉，徐 寧，崔毓桂

0 引 言

隨著糖尿病發(fā)病率的逐年增高，糖尿病性創(chuàng)面愈合障礙的發(fā)生率也在不斷上升。在我國，因創(chuàng)面因素入院的患者中糖尿病患者已達36%，占首位［1］。糖尿病是一種慢性炎性反應(yīng)疾病，其固有免疫炎癥細胞的功能障礙涉及全身各個系統(tǒng)［2-3］。糖尿病狀態(tài)下巨噬細胞的表型和功能均可發(fā)生改變，從而導(dǎo)致炎性反應(yīng)失調(diào)引起各種并發(fā)癥［4-6］。同樣，也有研究顯示糖尿病性創(chuàng)面常處于異常的炎性反應(yīng)環(huán)境中，并伴有巨噬細胞為主要來源的炎癥因子分泌障礙，這提示糖尿病性創(chuàng)面的愈合過程中也存在著失調(diào)的巨噬細胞炎性反應(yīng)［7-8］。本文擬通過觀察糖尿病大鼠創(chuàng)面愈合過程中巨噬細胞的浸潤數(shù)量及炎癥因子表達量變化情況，初步探討其與糖尿病鼠創(chuàng)面愈合障礙間的相關(guān)性。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 健康清潔級SD大鼠，雄性，35只，6～7周齡，體重180～220g，由南京醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心提供。實驗動物許可證號:SCXK(蘇)2013-0005。普通飼養(yǎng)環(huán)境，室溫控制于18～25℃，相對濕度50%，12 h光照12 h黑夜交替。普通顆粒飼料投喂，專人供水，創(chuàng)面造模前每籠5只，創(chuàng)面造模成功后單只單籠飼養(yǎng)。整個實驗過程符合實驗動物倫理學(xué)標(biāo)準(zhǔn)條例，實驗人員具備江蘇省動物實驗從業(yè)人員資質(zhì)。

1.2 主要實驗試劑 鏈脲佐菌素(Sigma公司)，小鼠抗大鼠CD68(Santa Cruz公司)，羊抗大鼠CCR7(Novus公司)，小鼠IgG SABC試劑盒及羊IgG FITCSABC試劑盒(武漢博士德公司)，Trizol、預(yù)混反轉(zhuǎn)錄試劑盒、SYBR Green Premix試劑盒(Takara公司)。

1.3 實驗方法

1.3.1 糖尿病大鼠模型建立 大鼠經(jīng)適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，檢測尾靜脈隨機血糖，血糖異常者剔除［9］。按隨機數(shù)字表法選取20只大鼠，稱重后按55 mg/kg劑量腹腔注射檸檬酸緩沖液(pH 4.2～4.5)稀釋的鏈脲佐菌素，稀釋濃度為4 mg/mL。72 h后檢測尾靜脈隨機血糖，血糖值＞16.7 mmol/L者入選，分別于造模1、3、8周后復(fù)測尾靜脈血糖。血糖持續(xù)＞16.7mmol/L達8周者視為糖尿病模型成模鼠入組。建模期間所有大鼠正常飲食，適當(dāng)供給蛋白質(zhì)。除外糖尿病造模過程中血糖恢復(fù)或因血糖波動死亡鼠，最終入組糖尿病鼠15只。

1.3.2 創(chuàng)面模型建立 糖尿病模型成模鼠為模型組，健康同齡對照鼠為對照組，每組15只，于術(shù)前1 d背部備皮，手術(shù)當(dāng)天腹腔注射水合氯醛(30 mg/kg)麻醉。常規(guī)消毒大鼠背部后，距大鼠顱后線3 cm背部正中處美蘭標(biāo)記，用手術(shù)刀及眼科剪造1 cm2全層皮膚缺損，紗布止血，數(shù)碼照相后貼膜覆蓋，膠布固定包扎。

1.3.3 創(chuàng)面取材 2組在創(chuàng)面形成后第3、7、14天分別按隨機數(shù)表法各抽取5只大鼠，水合氯醛腹腔麻醉后，數(shù)碼照相，距創(chuàng)緣外2mm處切取創(chuàng)周及全部創(chuàng)面肉芽組織，行形態(tài)學(xué)、免疫組織學(xué)及分子生物學(xué)檢測。

1.3.4 創(chuàng)面愈合率 計算公式如下:

創(chuàng)面愈合率=(原始創(chuàng)面面積-未愈合創(chuàng)面面積)/原始創(chuàng)面面積×100%

1.3.5 組織形態(tài)學(xué) 4%甲醛固定組織，經(jīng)乙醇梯度脫水后二甲苯透明，石蠟包埋，切5 μm厚切片，再經(jīng)脫蠟至水，行HE染色，光鏡觀察創(chuàng)面組織炎癥細胞浸潤情況。

1.3.6 巨噬細胞標(biāo)記和計數(shù) 創(chuàng)面組織切片脫蠟至水，后續(xù)過程依小鼠IgG即用型SABC試劑盒說明書進行，其中一抗為小鼠抗大鼠 CD68 1∶50。DAB顯色，中性樹膠封片后，顯微鏡下每張切片隨機計數(shù)5個高倍視野下CD68+細胞平均數(shù)。

1.3.7 創(chuàng)面組織中IL-12B、誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase，iNOS)、TNF-α 的 mRNA 測定 凍存組織取出后，采用Trizol法抽提出組織總RNA，經(jīng)預(yù)混反轉(zhuǎn)錄試劑盒反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，采用SYBR Green Premix試劑盒進行RT-PCR檢測。引物訂購自Invitrogen公司，引物序列如下:GUSB上游5'-TGAGAATCAACAGCGCCCAT-3'，下游 5'-CCTCCCTCATGTTCCACCAC-3';IL-12B上游5'-AGAAGTACTCAGTGGCGTGC-3'，下游 5'-GGTGGGTCCGGTTTGATGAT-3';iNOS上游5'-ACACAGTGTCGCTGGTTTGA-3'，下游 5'-AACTCTGCTGTTCTCCGTGG-3';TNF-α 上游 5'-CATCCGTTCTCTACCCAGCC-3'，下 游 5'-AATTCTGAGCCCGGAGTTGG-3';其中 β-葡萄糖苷酸酶(Glucuronidase，Beta Elisa Kit，GUSB)為內(nèi)參基因，反應(yīng)條件:95℃ 1min，95℃ 15s、60℃ 1min，共40 個循環(huán)，采用2-ΔCT法計算相對表達量。

1.3.8 創(chuàng)面組織CCR7熒光染色 創(chuàng)面組織切片脫蠟至水，后續(xù)過程依羊IgG FITC-SABC試劑盒說明書進行，其中一抗為羊抗大鼠 CCR7 1:100?？篃晒獯銣绶馄瑒┓夤毯螅怪脽晒怙@微鏡觀察高倍視野下CCR7陽性細胞染色情況。

1.4 統(tǒng)計學(xué)分析 采用SPSS18.0軟件進行統(tǒng)計分析，定量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示。圖像數(shù)據(jù)采用Image J軟件系統(tǒng)處理。兩樣本間比較采用t檢驗，指標(biāo)間采用Pearson直線相關(guān)分析，P≤0.05為有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 創(chuàng)面愈合率 在術(shù)后第3、7、14天時，模型組的創(chuàng)面愈合率均低于對照組［(29.5±5.4)%vs(45.9 ± 12.8)%、(71.6 ± 3.1)%vs(80.1 ±6.9)%、(93.9 ±2.8)%vs(99.4 ±1.4)%］，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。

2.2 創(chuàng)面組織HE染色結(jié)果 術(shù)后第3天時，對照組創(chuàng)面組織中可見明顯炎癥細胞浸潤，而模型組創(chuàng)面組織中的炎癥細胞浸潤密度較低;2組術(shù)后第7天時均有大量炎癥細胞浸潤;術(shù)后第14天時對照組可見炎癥細胞浸潤密度較第7天時明顯降低，而模型組創(chuàng)面中炎癥細胞浸潤密度變化不明顯，且模型組的炎癥細胞浸潤密度明顯高于對照組。見圖1。

2.3 創(chuàng)面組織CD68染色結(jié)果 術(shù)后第3天模型組創(chuàng)面中巨噬細胞數(shù)量較對照組少，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01);術(shù)后第7天2組創(chuàng)面內(nèi)均可見大量巨噬細胞浸潤，其中模型病組巨噬細胞浸潤密度高于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05);術(shù)后第14天可見模型組和對照組創(chuàng)面中巨噬細胞浸潤密度較各自組第7天均有所下降，但模型組創(chuàng)面中巨噬細胞浸潤密度仍明顯高于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P ＜0.01)。見圖2、圖3。

圖1 糖尿病大鼠與對照大鼠創(chuàng)面組織炎癥細胞浸潤情況(HE×200)Figure 1 Infiltration of inflammatory cells in wound tissues between the rats from DM group and control group(HE×200)

圖2 糖尿病大鼠與對照大鼠創(chuàng)面組織巨噬細胞浸潤密度(免疫組化染色 ×400)Figure 2 Infiltration densities of macrophagocytes between the rats from DM group and control group(IHC×400)

圖3 糖尿病大鼠與對照大鼠創(chuàng)面組織CD68+細胞數(shù)比較Figure 3 The amount CD68 of positive cells of the wound tissue at different time points

2.4 創(chuàng)面組織中巨噬細胞數(shù)和創(chuàng)面愈合率的相關(guān)性分析結(jié)果 針對本實驗2組小鼠，術(shù)后第3天時，創(chuàng)面巨噬細胞數(shù)和創(chuàng)面愈合率呈正相關(guān)(r=0.909，P＜0.01);術(shù)后第7天時兩者間無相關(guān)性(r=-0.135，P ＞0.05);術(shù)后第 14 天時兩者間呈負(fù)相關(guān)(r=-0.962，P ＜0.01)。見圖4。

2.5 創(chuàng)面組織中炎癥因子mRNA的檢測結(jié)果 第3天時，模型組 IL-12B、iNOS、TNF-α 的 mRNA 表達量均低于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。第7天時模型組IL-12B、iNOS的mRNA表達量較對照組高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)，而TNF-α的mRNA表達量較對照組低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。而在第 14 天時模型組 IL-12B、iNOS、TNF-α的mRNA表達量均高于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P ＜0.05)。見表1。

圖4 創(chuàng)面巨噬細胞浸潤密度和創(chuàng)面愈合率的相關(guān)性分析Figure 4 Correlation of wound macrophage density with the wound closure rate

表1 創(chuàng)面組織IL-12B、iNOS、TNF-α mRNA相對表達量(±s)Table 1 Relative expression of IL-12B，iNOS，TNF-α in different time points(±s)

表1 創(chuàng)面組織IL-12B、iNOS、TNF-α mRNA相對表達量(±s)Table 1 Relative expression of IL-12B，iNOS，TNF-α in different time points(±s)

分組 n IL-12B mRNA第3天 第7天 第14天mRNA第3天 第7天 第14天iNOS的mRNA第3天 第7天 第14天TNF-α的對照組 5 0.141 ±0.015 0.012 ±0.001 0.028 ±0.001 14.455 ±0.463 0.797 ±0.030 0.029 ±0.004 1.472 ±0.273 0.781 ±0.106 0.643 ±0.122模型組 5 0.055 ±0.015 0.057 ±0.019 0.134 ±0.026 11.206 ±1.897 0.946 ±0.058 0.279 ±0.045 1.023 ±0.038 0.359 ±0.126 1.038 ±0.115 t值 -6.911 4.304 7.157 -2.882 3.941 9.572 -2.814 -4.431 4.084 P 值 0.002 0.049 0.019 0.045 0.017 0.001 0.048 0.011 0.015

2.6 CCR7免疫熒光染色結(jié)果 術(shù)后第3天時，2組創(chuàng)面內(nèi)均出現(xiàn)多量陽性染色細胞，而模型組創(chuàng)面組織內(nèi)陽性染色細胞較對照組稀疏。術(shù)后第7天時，2組均有大量陽性染色細胞。術(shù)后第14天時，可見模型組創(chuàng)面內(nèi)仍殘留有較多陽性染色細胞，而對照組僅殘留極少數(shù)陽性染色細胞。見圖5。

圖5 糖尿病大鼠與對照大鼠創(chuàng)面組織陽性染色細胞比較結(jié)果(CCR7熒光染色 ×400)Figure 5 Comparison of positive staining cells in wound tissues between the rats from DM group and control group(×400)

3 討 論

炎癥反應(yīng)是創(chuàng)面愈合過程中的起始步驟，適度的炎癥反應(yīng)有助于創(chuàng)面的正常愈合［10-11］。作為創(chuàng)面中的主要炎癥反應(yīng)細胞，巨噬細胞對創(chuàng)面愈合過程中炎癥反映的調(diào)節(jié)具有重要意義［12-14］。目前，創(chuàng)面中已知的巨噬細胞可以具有M1型(經(jīng)典活化型，即促炎癥型)和M2型(選擇活化型，即促血管型)2種極化狀態(tài)。其中M1型巨噬細胞具有較強的炎癥反應(yīng)能力，可以合成大量iNOS并分泌大量炎癥因子如IL-12、IL-23、TNF-α 等，對創(chuàng)面愈合過程中的炎癥反應(yīng)起調(diào)節(jié)作用［15-17］。正常情況下，M1巨噬細胞出現(xiàn)在創(chuàng)面愈合的早期，分泌大量的炎癥因子和炎癥趨化因子，從而促進創(chuàng)面炎癥反應(yīng)，加強創(chuàng)面壞死組織和細胞清除，防止細菌侵襲。在完成炎癥反應(yīng)過程后巨噬細胞在創(chuàng)面局部的浸潤密度逐漸降低，殘余巨噬細胞也轉(zhuǎn)變?yōu)镸2型巨噬細胞，同時其炎癥因子的表達量逐漸下降，抗炎癥因子的分泌增強，從而減輕創(chuàng)面的炎癥反應(yīng)，促進創(chuàng)面的細胞增殖和血管化的形成［18-20］。糖尿病狀態(tài)下，巨噬細胞表型發(fā)生異常，主要表現(xiàn)為M1型巨噬細胞的數(shù)量和比例增高［21］，同時其分泌的炎癥因子水平上升，但其刺激活化后的炎癥因子表達能力和吞噬能力卻明顯減弱［6，22］。

本實驗結(jié)果表明糖尿病大鼠創(chuàng)面中的巨噬細胞早期浸潤數(shù)量較低與創(chuàng)面愈合率具有正相關(guān)性，而晚期殘留巨噬細胞數(shù)量較多且與創(chuàng)面愈合率具有負(fù)相關(guān)性。同時IL-12、IL-23、iNOS 、TNF-α mRNA 表達量的變化與之基本吻合，其為創(chuàng)面愈合過程中具有代表性的炎癥因子，主要由M1巨噬細胞表達分泌，其mRNA表達量的高低反映了巨噬細胞的極化狀態(tài)及創(chuàng)面炎癥反應(yīng)的強度。本研究選擇IL-12B作為評估IL-12和IL-23 mRNA表達量的指標(biāo)是因為IL-12B(即IL-12p40)是IL-12和IL-23共有的亞基，決定著IL-12和IL-23的合成量，并與炎癥的強度密切相關(guān)［23］。目前，關(guān)于M1型巨噬細胞的表面特異性標(biāo)記尚未達成共識，本研究選擇CCR7作為評估創(chuàng)面M1型巨噬細胞的標(biāo)記，是因為CCR7在人和動物的M1型巨噬細胞中都具有較好的代表性［24］。然而需注意的是CCR7有時也在淋巴細胞和部分樹突狀細胞的亞群中有所表達［25］，由于這些細胞在創(chuàng)面愈合中的浸潤數(shù)量遠低于巨噬細胞［26］，所以雖然不能采取定量的方法比較2組創(chuàng)面內(nèi)M1型巨噬細胞的數(shù)量，但結(jié)合鏡下所見的圖像和相關(guān)炎癥因子的表達情況，依然可以推測出糖尿病創(chuàng)面愈合晚期時仍有多量M1型巨噬細胞殘留。Mirza等［27］發(fā)現(xiàn)術(shù)后第10天時糖尿病創(chuàng)面中仍然留有較多的M1型巨噬細胞，同時伴有生長因子表達量的下降和炎癥因子表達量的上升。愈合晚期增強的炎癥反應(yīng)不利于創(chuàng)面的愈合，可以導(dǎo)致創(chuàng)面上皮化的失敗和血管化的困難，然而導(dǎo)致糖尿病創(chuàng)面晚期炎癥反應(yīng)增強的原因，目前并不明確。

創(chuàng)面愈合早期適當(dāng)?shù)难仔苑磻?yīng)有助于創(chuàng)面的正常愈合，正常巨噬細胞在吞噬和清除凋亡的組織和細胞后其炎癥因子分泌功能下降，逐漸凋亡并被其他巨噬細胞吞噬清除［28］。同時巨噬細胞分泌的部分炎癥因子可以有效刺激抗炎癥因子的分泌，加速炎癥反應(yīng)的消退，例如IL-12可以經(jīng)由負(fù)反饋機制刺激抗炎癥因子IL-10的分泌［29］。而糖尿病狀態(tài)下的巨噬細胞吞噬速度較正常慢5倍以上［30］，可能導(dǎo)致創(chuàng)面壞死組織及調(diào)往細胞清除較慢持續(xù)趨化巨噬細胞浸潤，同時已趨化至創(chuàng)面的巨噬細胞也無法順利完成凋亡過程，并且由于炎癥因子的分泌功能下降，糖尿病創(chuàng)面不能形成有效的負(fù)反饋機制抑制炎癥反應(yīng)，最終導(dǎo)致了愈合后期創(chuàng)面巨噬細胞的浸潤增多、炎癥反應(yīng)增強。本實驗結(jié)果顯示第3天時創(chuàng)面巨噬細胞數(shù)與創(chuàng)面愈合率呈正相關(guān)性，但模型組創(chuàng)面內(nèi)巨噬細胞明顯低于對照組，且炎癥反應(yīng)強度較弱，提示創(chuàng)面內(nèi)巨噬細胞數(shù)量不足，無法完成有效的炎癥反應(yīng)過程，并且由于糖尿病狀態(tài)下的巨噬細胞吞噬及炎癥因子表達功能均受損，更降低了愈合早期的炎癥反應(yīng)效能，導(dǎo)致了后期持續(xù)的炎癥反應(yīng)增強。

糖尿病作為一種全身系統(tǒng)性疾病，其創(chuàng)面巨噬細胞的浸潤和功能的障礙僅僅是全身病變在局部的表現(xiàn)，患者全身免疫炎癥的狀態(tài)也會對創(chuàng)面的愈合產(chǎn)生不良影響。本實驗僅初步證明了STZ誘導(dǎo)的糖尿病大鼠創(chuàng)面模型中巨噬細胞早期浸潤密度較低炎癥反應(yīng)強度較低，而晚期持續(xù)停留于創(chuàng)面且炎癥反應(yīng)增強，這可能與糖尿病創(chuàng)面愈合障礙有一定的相關(guān)性。

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