劉樂南，馮振華，李 潔，戴毅敏，朱海燕，許碧云，周乙華，胡婭莉

0 引 言

胎兒是一個半抗原移植物，成功的妊娠要求母體免疫系統(tǒng)對其充分耐受，而最復(fù)雜、也是首當(dāng)其沖的免疫反應(yīng)發(fā)生在母胎界面［1］。近年研究表明，很多重要妊娠并發(fā)癥如早產(chǎn)、子癇前期等都與母胎界面局部的炎癥免疫過度激活有關(guān)［2-4］。由于人類妊娠過程中很難獲得標(biāo)本以研究母胎界面局部炎癥免疫狀況，而羊水中炎癥相關(guān)的細(xì)胞因子濃度則可能成為反映母胎界面炎癥免疫狀態(tài)的窗口。為了解正常妊娠時羊水中炎性細(xì)胞因子的情況，為今后病理妊娠的研究提供參照，本研究利用高靈敏度MILLIPLEX MAP試劑及Luminex儀器對妊娠結(jié)局正常的中孕期羊水進行了主要炎性細(xì)胞因子的檢測。

1 資料與方法

1.1 研究對象 選取2009年4月至2012年3月323例因中孕期母血清唐氏綜合征篩查高風(fēng)險、孕婦高齡等原因在我院行羊膜腔穿刺的孕婦為研究對象，羊水采集孕周為18～22+6周，隨訪妊娠經(jīng)過、分娩孕周及有無胎膜早破、有無絨毛膜羊膜炎、新生兒性別、出生體重、新生兒是否有肺炎及敗血癥等內(nèi)容，將胎兒染色體異常、胎兒結(jié)構(gòu)異常、早產(chǎn)、多胎妊娠、有妊娠并發(fā)癥、有明顯宮內(nèi)感染跡象以及穿刺前7 d內(nèi)用過抗生素者排除。本研究獲得南京醫(yī)科大學(xué)鼓樓臨床學(xué)院倫理委員會批準(zhǔn)，并獲得孕婦知情同意。

1.2 研究方法

1.2.1 標(biāo)本采集及處理 在B超引導(dǎo)下經(jīng)腹羊膜腔穿刺采集羊水27 mL，其中最初2 mL棄去，20 mL用于胎兒染色體檢查，余5 mL用于本實驗。樣本離心(13000r/min、4℃、10min、離心半徑6cm)分離上清和沉淀，分別保存于-30℃。

1.2.2 細(xì)胞因子檢測方法 采用MILLIPLEX MAP Human Cytokine/Chemokine Magnetic Bead Panel(美國Merck公司)，按試劑盒說明制備10000 pg/mL標(biāo)準(zhǔn)品、高濃度和低濃度質(zhì)控品及5種細(xì)胞因子混合磁珠，并將標(biāo)準(zhǔn)品以5倍稀釋以制定標(biāo)準(zhǔn)曲線，儲存標(biāo)本于室溫融化并混勻，離心(13000 r/min、4℃、10 min、離心半徑6 cm)后取上清待測，將25 μL標(biāo)準(zhǔn)品、質(zhì)控品及待測標(biāo)本分別與25 μL預(yù)混磁珠和25 μL緩沖液混合，并置于4℃震蕩過夜。次日將反應(yīng)體系置于磁板上，清洗反應(yīng)體系后，先加入25 μL檢測抗體于室溫震蕩反應(yīng)1 h，再加入25 μL顯色劑于室溫震蕩反應(yīng)30 min，再次將反應(yīng)體系置于磁板上，清洗反應(yīng)體系后加入150 μL鞘液并使用Luminex公司液相芯片分析系統(tǒng)進行細(xì)胞因子的定量分析。每個樣本均采用復(fù)孔，結(jié)果取平均值。本研究IL-10、IL-1β、IL-6、MCP-1 和 TNF-α 的靈敏度分別為0.61、0.05、0.14、0.54 和 0.25 pg/mL。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析 采用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件分析處理數(shù)據(jù)。孕婦年齡、新生兒體重、取樣和分娩孕周均采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示。對各種細(xì)胞因子水平的分布進行W檢驗，根據(jù)其非正態(tài)分布特征，各細(xì)胞因子濃度均采用中位數(shù)(M)、最小值(Min)和最大值(Max)描述，以Mann-Whitney檢驗不同胎兒性別間五種細(xì)胞因子水平比較，以Kruskall-Wallis檢驗對不同孕周和孕婦年齡間五種細(xì)胞因子水平比較。采用P 2.5～P 97.5確定細(xì)胞因子參考范圍。P≤0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

323例孕婦中6例胎兒染色體異常、13例早產(chǎn)、41例出現(xiàn)妊娠期高血壓疾病、妊娠期糖尿病等妊娠并發(fā)癥，故排除上述60例孕婦，其余妊娠結(jié)局正常的263名孕婦為最終研究對象。孕婦平均年齡(30.15±5.68)歲，平均取樣和分娩孕周分別為(20.3±1.1)周和(39.7 ±1.0)周。263 例孕婦中106名經(jīng)陰道分娩，余157名因胎位不正、頭盆不稱等原因行剖宮產(chǎn)。新生兒平均出生體重為(3.5±0.4)kg，男嬰135 名、女嬰128 名。

2.1 中孕期羊水 IL-10、IL-1β、IL-6、MCP-1、TNF-α水平以及性別的影響 263例中孕期羊水細(xì)胞因子水平結(jié)果見表1。孕女性胎兒孕婦中孕期羊水IL-10和IL-1β低于孕男性胎兒孕婦，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P ＜0.05)。2 組間 IL-6、MCP-1 和TNF-α差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P ＞0.05)。

2.2 中孕期不同孕周對羊水 IL-10、IL-1β、IL-6、MCP-1、TNF-α水平的影響 妊娠18～22+6周各周羊水中細(xì)胞因子的平均水平見表2。5種細(xì)胞因子各組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)，IL-6水平雖然隨孕周增加而呈增高趨勢，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P ＞0.05)。

2.3 孕婦年齡對中孕期羊水 IL-10、IL-1β、IL-6、MCP-1、TNF-α水平的影響 263名孕婦按組距5歲分組，20～24歲者47名、25～29歲者95名、30～34歲者52名以及69名≥35歲的高齡產(chǎn)婦。不同年齡段孕婦各指標(biāo)差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。見表3。

表1 中孕期不同性別胎兒孕婦羊水細(xì)胞因子比較(pg/mL)Table 1 Fetal gender and cytokines levels in amniotic fluid at mid-trimester(pg/mL)

表2 孕婦不同孕周羊水細(xì)胞因子水平［M(Min～Max)，pg/mL］Table 2 Cytokines in amniotic fluid at the 18th-22ndgestational week(M［Min-Max］，pg/mL)

表3 孕婦年齡與細(xì)胞因子水平［M(Min～Max)，pg/mL］Table 3 Maternal age and cytokines levels in amniotic fluid at mid-trimester(M［Min-Max］，pg/mL)

3 討 論

細(xì)胞因子是維持機體正常免疫功能的重要成份，反映了機體全身或局部炎癥免疫的狀態(tài)。妊娠后，在母胎界面除母體的免疫細(xì)胞外，子宮蛻膜細(xì)胞和滋養(yǎng)細(xì)胞也能合成相關(guān)細(xì)胞因子，為胎盤著床、母體免疫耐受形成、維持胎兒宮內(nèi)生長發(fā)育提供必要的條件［5］。有研究表明，中孕期羊水中炎癥相關(guān)細(xì)胞因子增高可能與很多妊娠并發(fā)癥相關(guān)［6-11］，但對于正常妊娠中期羊水中細(xì)胞因子水平并不十分了解。

3.1 影響羊水中炎性細(xì)胞因子濃度的因素 本研究發(fā)現(xiàn)孕男性胎兒孕婦的中孕期羊水中IL-10和IL-1β水平略高于孕女性胎兒孕婦。提示男性胎兒母胎界面局部炎癥反應(yīng)可能比女性胎兒激烈。因本研究的研究對象均為正常妊娠結(jié)局者，故尚不能說明上述因子增高有何臨床意義。

妊娠過程中羊水成分在不斷變化，高齡孕婦相對適齡孕婦發(fā)生妊娠并發(fā)癥的風(fēng)險也在增加，因此本研究就孕齡及孕婦年齡對細(xì)胞因子水平的影響做了研究。結(jié)果顯示胎兒性別及孕婦年齡、孕齡均不影響IL-6、MCP-1、TNF-α的水平，與既往研究結(jié)果一致［12-13］。提示此3種因子在中孕期羊水中的穩(wěn)定性及作為預(yù)測不良妊娠結(jié)局指標(biāo)的獨立性。

3.2 與既往研究中孕期羊水 IL-10、IL-1β、IL-6、MCP-1、TNF-α檢測水平的比較 本研究正常孕婦中孕期羊水中5種細(xì)胞因子檢測水平與其他研究結(jié)果差異較大。Perni等［14］使用ELISA檢測結(jié)果顯示IL-1β和IL-6水平分別約是本研究結(jié)果的17倍和7倍，但TNF-α水平卻較本研究結(jié)果低。而本研究結(jié)果顯示 IL-1β、IL-6和 TNF-α 水平均低于 Chow等［12］使用Bio-Plex細(xì)胞因子檢測試劑盒檢測結(jié)果，但Chow等［12］研究結(jié)果中IL-1β和IL-6水平仍明顯低于Perni等［14］研究結(jié)果。即使是同一國家，其檢測水平也存在明顯差異［14-15］。不同國家地區(qū)間正常孕婦中孕期羊水中五種細(xì)胞因子檢測水平存在較大差異，這可能是因為各研究對象的人種以及檢測細(xì)胞因子水平的試劑盒等不同引起。因此，在進行相關(guān)研究時，各實驗室應(yīng)根據(jù)研究對象基本特征及試劑盒的不同，設(shè)立相應(yīng)對照組，確定相應(yīng)的參考值。

3.3 羊水中細(xì)胞因子檢測方法 羊水中細(xì)胞因子反應(yīng)了母胎界面的炎癥免疫應(yīng)答，而此類炎性細(xì)胞因子并非細(xì)菌感染刺激產(chǎn)生，而主要是內(nèi)源性分子刺激所致，故羊水中炎性細(xì)胞因子濃度較低，故羊水中炎性細(xì)胞因子的檢測需要靈敏度高的檢測方法。本研究采用靈敏度較高的Luminex公司液相芯片分析系統(tǒng)及MILLIPLEX MAP細(xì)胞因子檢測試劑檢測羊水細(xì)胞因子，其檢測原理為含有2種熒光染料的內(nèi)在顏色編碼微磁珠，每個珠子上都包被有特異性的捕獲抗體，并通過染料的不同濃度確定不同的磁珠捕獲檢測樣本中的分析物，加入生物素標(biāo)記的檢測抗體后與作為報告分子的顯色劑結(jié)合，待液相芯片分析系統(tǒng)中兩種激光分別激發(fā)磁珠內(nèi)部染料及報告分子上熒光染料，高速數(shù)字信號將處理識別每個磁珠，并通過熒光報告信號即可定量生物分析的結(jié)果。這種磁珠的微小體積、液體懸浮性、快速動力學(xué)以及高面積體積比使得此試劑盒靈敏度高，且僅需50 μL樣本就可以同時檢測多種細(xì)胞因子，從而為珍貴樣本檢測提供了保障。

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