孫春紅，陳 剛，王鳳君，閆柏剛

0 引 言

自噬(Autophagy)即自體吞噬，是生物體通過溶酶體或囊泡降解胞內(nèi)成分的總稱，系指來源于粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)無核糖體附著區(qū)的雙層膜包裹部分胞質(zhì)和細胞內(nèi)需要降解的細胞器、蛋白質(zhì)等成分形成自噬體，然后與溶酶體融合形成自噬溶酶體，降解其所包裹的內(nèi)容物，從而實現(xiàn)細胞本身的代謝需要和某些細胞器的更新［1-2］。目前的研究認為，自噬不僅在細胞生長與發(fā)育中起重要作用，而且在應對各種應激及多種疾病如缺血缺氧性損害、炎癥反應等的發(fā)生與發(fā)展中也發(fā)揮著關鍵作用［2-6］。但嚴重燒傷后器官組織細胞的具體自噬情況，以及在燒傷后器官結(jié)構(gòu)和功能的改變中發(fā)揮何種作用，目前尚無相關研究資料。本研究利用BALB/C小鼠建立30%TBSA的Ⅲ度體表燙傷模型，動態(tài)觀察嚴重燙傷早期心、肝、肺、腎實質(zhì)器官細胞自噬的變化，旨在了解嚴重燒傷對組織細胞自噬的影響，為進一步研究自噬在嚴重燒傷后器官結(jié)構(gòu)與功能損害中的作用奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 實驗材料 BALB/C小鼠購自第三軍醫(yī)大學實驗動物中心，合格證號:SYXK(渝)20120002。LC3B抗體、Beclin 1抗體均購自美國Sigma公司;全蛋白提取試劑盒購自凱基生物;辣根過氧化物酶(horseradish peroxidase，HRP)標記二抗為美國Southern Biotech公司產(chǎn)品;超敏化學發(fā)光試劑盒由美國GE公司提供;蛋白測定試劑盒、小型垂直電泳儀、電轉(zhuǎn)儀、聚偏二氟乙烯(polyvinylidene difluoride，PVDF)膜、蛋白印跡相關試劑及ChemiDoc XRS型凝膠圖像分析系統(tǒng)為美國Bio-Rad公司產(chǎn)品;H-600型透射電鏡購自日本日立公司。

1.2 小鼠Ⅲ度燙傷模型的制作 選取6～8周齡的清潔級BALB/C小鼠24只，雌雄不拘，體重20～25g，飼養(yǎng)環(huán)境(22±2)℃，常規(guī)飼料喂養(yǎng)，自由飲水。將24只小鼠簡單隨機分組法分成6組，每組4只，即燙傷前(正常對照)組、燙傷后1 h組、2 h組、6 h組、12 h組和24 h組。所有小鼠均用剃推剪和8%硫化鈉去除背部毛發(fā)。除燙傷前組外，其余5組的20只小鼠于90℃水浴鍋中燙傷已脫毛的背部皮膚10 s，造成30%TBSA的Ⅲ度燙傷(經(jīng)病理切片證實)，傷后立即腹腔注射1 mL等滲鹽水，自由進食水。取各組小鼠心、肝、肺、腎器官組織標本，分別用2.5%戊二醛保存用于透射電鏡或液氮保存待用于蛋白表達分析。

1.3 指標檢測與方法

1.3.1 器官組織Beclin 1與LC3蛋白表達的檢測采用蛋白免疫印跡法檢測Beclin 1與LC3蛋白表達，方法簡述如下:用全蛋白提取試劑盒提取各器官組織全蛋白提取物，取上清用RC DC蛋白測定試劑盒測定蛋白含量。所提取蛋白經(jīng)100℃水浴5 min后，進行8%～12%SDS-PAGE電泳并轉(zhuǎn)移至PVDF膜。以5%脫脂奶室溫封閉1 h，向PVDF膜滴加Beclin 1或LC3一抗(稀釋度為1∶1000)，以β肌動蛋白作內(nèi)參(稀釋度為1∶5000)。4℃孵育過夜后，用TBST洗膜4次，滴加經(jīng)1∶5000稀釋的HRP-羊抗鼠IgG或HRP-羊抗兔IgG，室溫孵育1 h。用 TBST洗膜4次后，用化學發(fā)光試劑盒檢測，經(jīng)ChemiDoc XRS型凝膠圖像分析系統(tǒng)采集信號。Quantity One軟件進行相對定量分析，LC3的相對表達量是以LC3Ⅰ與LC3Ⅱ的比值表示，Beclin 1的相對表達量是以其與內(nèi)參β肌動蛋白的比值表示。

1.3.2 透射電鏡檢測自噬 器官組織用2.5%戊二醛(磷酸緩沖液配制，pH 7.2～7.4)于4℃固定2～4 h，0.1 mol/L 磷酸緩沖液漂洗(30 min/次 × 2次)，1%鋨酸4℃固定2 h。固定后的樣本經(jīng)丙酮梯度脫水后，用丙酮:環(huán)氧樹脂1∶1浸泡1h，在40℃烤箱中先后用純包埋劑和包埋劑分別處理2 h。最后用環(huán)氧樹脂618包埋半薄切片定位、超薄切片，鉛染色，置于電鏡下觀察拍照。

1.4 統(tǒng)計學分析 采用SPSS13.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計分析，定量數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差(±s)表示，多組間均數(shù)比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用Dunnett-t檢驗，以P≤0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié) 果

2.1 燙傷后各器官組織自噬相關蛋白Beclin 1和LC3表達的變化 與燙傷前組相比較，小鼠燙傷后1 h心、肝、肺、腎組織Beclin 1及LC3蛋白表達均開始逐漸增加，肝、肺、腎組織Beclin 1及LC3蛋白表達于傷后12 h達高峰，隨后回落，但至傷后24 h時仍高于正常對照。心組織Beclin 1及LC3蛋白表達則是持續(xù)性逐漸增加，至傷后24 h時仍顯著高于正常對照。見表1、表2。免疫印跡結(jié)果見圖1、圖2。

表1 燙傷前后各器官組織Beclin 1蛋白表達的動態(tài)變化(±s，n=4)Table 1 Beclin-1 protein expression in the internal organs of the mice before and after scald(±s，n=4)

表1 燙傷前后各器官組織Beclin 1蛋白表達的動態(tài)變化(±s，n=4)Table 1 Beclin-1 protein expression in the internal organs of the mice before and after scald(±s，n=4)

與燙傷前比較，*P ＜0.05

器 官不同時間Beclin 1 24 h心0.60 ±0.16 0.70 ±0.19 0.96 ±0.09* 1.02 ±0.06* 1.18 ±0.05* 1.68 ±0.54蛋白表達量燙傷前 燙傷后1 h 燙傷后2 h 燙傷后6 h 燙傷后12 h 燙傷后*肝0.65 ±0.20 0.95 ±0.11* 0.99 ±0.10* 1.21 ±0.13* 1.37 ±0.18* 0.81 ±0.23肺0.80 ±0.07 0.88 ±0.08 1.00 ±0.05* 1.10 ±0.07* 1.27 ±0.06* 1.00 ±0.17腎0.70 ±0.14 0.82 ±0.12 0.95 ±0.13* 1.16 ±0.12* 1.51 ±0.20*0.87 ±0.21

表2 燙傷前后各器官組織LC3蛋白表達的動態(tài)變化(±s，n=4)Table 2 LC3 protein expression in the internal organs of the mice before and after scald(±s，n=4)

表2 燙傷前后各器官組織LC3蛋白表達的動態(tài)變化(±s，n=4)Table 2 LC3 protein expression in the internal organs of the mice before and after scald(±s，n=4)

與燙傷前比較，*P ＜0.05

器 官不同時間LC3 24 h心2.58 ±0.93 3.48 ±1.25 4.25 ±1.55* 4.38 ±1.69* 5.20 ±1.83* 6.08 ±2.04蛋白表達量燙傷前 燙傷后1 h 燙傷后2 h 燙傷后6 h 燙傷后12 h 燙傷后*肝0.91 ±0.24 1.24 ±0.52 1.35 ±0.43* 1.60 ±0.44* 2.03 ±0.57* 1.03 ±0.37肺0.87 ±0.29 1.12 ±0.27 1.20 ±0.33* 1.30 ±0.45* 1.66 ±0.59* 1.19 ±0.38腎0.68 ±0.21 1.05 ±0.41 1.39 ±0.57* 1.48 ±0.71* 2.12 ±0.75*1.01 ±0.17

圖1 燙傷前后各器官Beclin 1蛋白表達Figure 1 Beclin-1 protein expression in the internal organs of the mice before and after scald

圖2 燙傷前后各器官LC3蛋白表達的變化Figure 2 LC3 protein expression in the internal organs of the mice before and after scald

2.2 透射電鏡變化 透射電鏡觀察是目前確定自噬的重要形態(tài)學指標，為此我們利用透射電鏡觀察了燙傷前后心、肝、肺、腎組織細胞自噬的變化，結(jié)果見圖3。與燙傷前組相比較，燙傷后6 h時心、肝、肺、腎組織胞內(nèi)均出現(xiàn)自噬溶酶體增多，即細胞自噬增加。

圖3 燙傷前后各器官細胞自噬的變化Figure 3 Autophagy in the internal organs of the mice before and after scald

3 討 論

眾所周知，嚴重燒傷早期的病理生理變化極其復雜，常常發(fā)生應激反應、休克、缺血缺氧性損害、炎癥反應、免疫功能紊亂、高代謝反應等病理生理反應，而且這些病理生理反應又常交替并相互影響，最終導致各器官結(jié)構(gòu)與功能受損，嚴重時常發(fā)生多器官功能不全綜合征(multiple organ dysfunction syndrome，MODS)。有研究資料表明［7-9］，嚴重燒傷后MODS的發(fā)生率高達28.1%，一旦發(fā)生極難逆轉(zhuǎn)，病死率達78%～98%。雖然近年來燒傷綜合救治水平在不斷提高，但嚴重燒傷后MODS的防治仍然是當前燒傷臨床所面臨的一道難題。究其根本原因，可能主要與對嚴重燒傷后器官組織結(jié)構(gòu)與功能損害的發(fā)生機制仍不完全清楚有關。

過去大量的研究表明［10-12］，燒傷可通過多種因素引起Ⅰ型程序性細胞死亡即凋亡增加，且細胞凋亡在燒傷后器官組織結(jié)構(gòu)及功能損害或MODS的發(fā)生中具有重要作用。那么，同屬于程序性細胞死亡的Ⅱ型程序性細胞死亡即自噬在嚴重燒傷后是否也發(fā)生變化呢?目前的研究尚不清楚。為此，本實驗觀察了小鼠嚴重燙傷早期心、肝、肺、腎實質(zhì)器官組織細胞自噬的動態(tài)變化。結(jié)果表明:小鼠遭受30%TBSA的Ⅲ度燙傷后，作為自噬重要標記分子的Beclin 1及LC3在心、肝、肺、腎組織的蛋白表達于傷后1 h即開始增加，且隨著傷后時間的延長更進一步增加，肝、肺、腎組織Beclin 1及LC3蛋白表達于12h達高峰，隨后回落，但至24 h時仍高于傷前，心組織Beclin 1及LC3蛋白表達更是持續(xù)性逐漸增加。既往的研究資料表明［13-14］，自噬的發(fā)生受到多種自噬相關基因的調(diào)控，其中Beclin 1與LC3在自噬小體的形成過程中均發(fā)揮著不可缺少的重要作用，它們表達水平的上調(diào)可以促進自噬的發(fā)生，被認為是自噬形成的標志性分子。因此，小鼠嚴重燙傷后各器官組織Beclin 1與LC3蛋白表達水平升高，表明組織細胞自噬增加。同時，本實驗的透射電鏡結(jié)果也顯示嚴重燙傷小鼠心、肝、肺、腎組織自噬溶酶體增多，與上述的自噬相關蛋白Beclin 1和LC3結(jié)果一致。綜合來看，小鼠嚴重燙傷后心、肝、肺、腎組織細胞自噬明顯增加。至于小鼠燙傷后24 h時心臟組織Beclin 1與 LC3表達持續(xù)上升，而肝、肺、腎組織Beclin 1與LC3表達則回落的原因，目前尚不清楚，推測可能與器官自身的組織學結(jié)構(gòu)、缺血缺氧程度、信號通路、炎性細胞因子水平、活性氧產(chǎn)生不同等有關，但仍有待證實。

嚴重燒傷后器官組織自噬增加的意義目前尚難以確定。過去的研究認為［15-17］，自噬在細胞存活與死亡中是把雙刃劍，對細胞的存活和死亡都有作用。適度自噬是細胞進行自身代謝和細胞器更新的一種重要方式，利于細胞存活，對維持機體內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定以及調(diào)控細胞損傷有重要意義;但過度自噬則會引起細胞過多死亡，從而引起組織器官損害。最近有研究資料表明［18］，SD大鼠遭受30%TBSA的Ⅲ度燙傷后的12 h內(nèi)心肌細胞自噬顯著增強，從而使心肌細胞過度死亡，導致心功能降低，而抑制自噬可減輕心功能損害。這一研究資料提示，嚴重燒傷引起的心肌細胞自噬活動增強可能是燒傷后心肌損害與心功能降低的重要原因之一。但本實驗發(fā)現(xiàn)的小鼠嚴重燙傷后心、肝、肺、腎組織細胞自噬增加是否也與各器官組織結(jié)構(gòu)及功能損害有關，有待進一步研究證實。

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