熊蕊+郭鳳柳+劉曉慧+趙同欣+王娜+顏紅

摘要：根據(jù)羊特異性線粒體DNA片段，設(shè)計合成一對引物，并以生、熟羊肉為材料，建立了肉制品中羊源性成分的PCR檢測方法，并用于生、熟羊肉的鑒定。PCR擴增產(chǎn)物DNA片段大小為295 bp。用Sau3AⅠ限制性內(nèi)切酶進(jìn)行酶切鑒定，酶切產(chǎn)物為204 bp和91 bp。PCR產(chǎn)物和酶切產(chǎn)物的片段大小與預(yù)期目標(biāo)相符，其檢測靈敏度達(dá)到0.225 pg DNA。合成的羊源性DNA引物可以擴增出羊肉的目的DNA片段，而對馬、狗、驢、兔和豬等14種動物DNA無擴增效果。利用該法對83份羊肉制品進(jìn)行鑒定，檢出率為100%。結(jié)果表明，該法快速簡便，且具有較高的特異性和敏感性，可用于市售牛肉制品中牛源性成分的鑒定。

關(guān)鍵詞：羊源性成分；PCR；檢測；靈敏度；特異性

中圖分類號：S826.9+2 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A 文章編號：0439-8114（2014）19-4694-04

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2014.19.049

Establishment and Application of Detecting Sheep

Ingredient in Meat Products PCR

XIONG Rui， GUO Feng-liu， LIU Xiao-hui， ZHAO Tong-xin， WANG Na， YAN Hong

（Baoding Entry-exit Inspection and Quarantine Bureau， Baoding 071051， Hebei， China）

Abstract： A PCR method for detecting the sheep ingredient in meat products based on the sheep specific mitochondrial DNA fragment was established. A pair of special primer was designed to amplified 295 bp fragment of sheep. A Sau3AⅠdigestion was simultaneously made to verify the specificity of the PCR amplification. The results showed that a specific amplification fragment of the expected size was obtained and confirmed that it was positive for sheep meat， but negative for horse， canis， donkey， rabbit and pig meat etc. The detection limit was 0.225 pg DNA. The 83 meat products of sheep were detected using PCR method， with the positive rate of 100%. It is indicated that the method is quick， convenient， sensitive and specific， and can be used for identifying of ovine components from sheep products.

Key words： sheep ingerdient； PCR； detection； sensitivity； specificity

羊肉包括綿羊肉和山羊肉，因其具有天然的滋補功效，長期以來都受到廣大消費者的青睞。隨著市場流通的日益發(fā)達(dá)，羊肉經(jīng)過冷凍、加工后再出售已成為現(xiàn)代市場營銷的主要手段，但是羊肉一般經(jīng)過冷凍，特別是經(jīng)過加工后的熟羊肉通過感官檢查已很難區(qū)分真?zhèn)?，因而一些不法商販在高額利潤的驅(qū)使下，在肉制品的生產(chǎn)與銷售中利用鴨肉或豬肉以假充真、以次充好[1]，這引起了廣大消費者的強烈憤慨。這不僅僅涉及到了經(jīng)濟、營養(yǎng)等問題，更直接影響著消費者的健康，尤其是對某些食物過敏的消費者[2、3]。此外，還會涉及到宗教信仰的問題，如在清真食品中摻雜進(jìn)豬肉等[4]。

目前，采用免疫學(xué)方法可以對不同的生鮮肉進(jìn)行鑒定[5]，但是對于熱加工處理的肉類制品，由于其中的蛋白質(zhì)成分或免疫原性物質(zhì)遭破壞而無法對其來源進(jìn)行準(zhǔn)確鑒定。因此，建立一種對肉類制品準(zhǔn)確、特異和靈敏度高的鑒別方法，對食品監(jiān)管部門而言已迫在眉睫。隨著研究技術(shù)的發(fā)展，食品中肉類成分的鑒別與分析已逐步形成了分別以蛋白質(zhì)和核酸檢測為基礎(chǔ)的方法體系，其鑒別精度可達(dá)屬或亞屬水平，檢測靈敏度也達(dá)到了納克級[6]，以PCR技術(shù)為基礎(chǔ)的種屬檢測技術(shù)最為突出。因此，本研究根據(jù)羊特異性線粒體DNA片段，設(shè)計合成一對引物，利用引物建立一種運用PCR技術(shù)鑒定真假羊肉的方法，并對大量市售羊肉制品進(jìn)行羊源性成分檢測，為保護廣大消費者的利益和進(jìn)一步落實食品質(zhì)量安全市場準(zhǔn)入制度提供了技術(shù)保障，也更好地為食品監(jiān)管部門提供強有力的技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗用羊、馬、狗、驢和兔等15種動物生鮮肉均為市售。熟羊肉、高壓羊肉（121 ℃，高壓30 min）均為河北檢驗檢疫技術(shù)中心保定分中心加工。

1.2 儀器與試劑

1-15PK型臺式離心機（德國Sigma公司）；Veriti型梯度PCR儀（美國ABI公司）；HT4型凝膠成像系統(tǒng)（法國VILBER LOURMAT公司）；PS300-B型電泳儀（美國Hoefer公司）。

試劑：10×PCR緩沖液、Taq DNA聚合酶、MgCl2、dNTPs、Sau3AⅠ限制性內(nèi)切酶、DNA Marker 2000、蛋白酶K、RNA酶、血液/細(xì)胞/組織基因組DNA提取試劑盒和凝膠回收純化試劑盒等均購自北京天根生化科技有限公司；PCR擴增引物由上海生工生物工程有限公司合成；其余試劑均為分析純。

1.3 試驗方法

1.3.1 引物設(shè)計與合成 根據(jù)GenBank中羊源性特異性DNA引物序列，利用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計合成一對特異性羊源引物。引物用高壓滅菌后的去離子水溶解并配制成100 mol/L的儲備液。引物序列：上游引物序列為5-TATTAGGCCTCCCCCTTGTT-3；下游引物序列為5-CCCTGCTCATAAGGGAATAGCC-3。引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。

1.3.2 樣品DNA的提取 取絞碎的羊、馬、狗、驢、兔等15種動物生鮮肉及熟羊肉和高壓羊肉，按照血液/細(xì)胞/組織基因組DNA提取試劑盒說明書提取模板DNA。取適量模板DNA，使用核酸蛋白分析儀或紫外分光光度計分別檢測260和280 nm處的吸光值A(chǔ)260和A280。A260/A280比值為1.7～1.9，適宜于PCR擴增。

1.3.3 PCR擴增 PCR反應(yīng)體系為50 μL，各成分含量為：10×PCR反應(yīng)緩沖液5 μL，25 mmol/L MgCl2 溶液3.0 μL，2.5 mmol/L 4×dNTPs 4.0 μL，引物sheepF和sheepR（25 μmol/L）各1.0 μL，DNA 模板1.0 μL，Taq DNA聚合酶1 U，無菌去離子水31.0 μL，混勻后離心，在PCR儀上開始循環(huán)。循環(huán)參數(shù)為：95 ℃預(yù)變性3 min，95 ℃變性60 s，56 ℃退火60 s，72 ℃延伸60 s，30個循環(huán)。72 ℃延伸5 min。最后4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.4 PCR產(chǎn)物鑒定 ①電泳鑒定。取擴增產(chǎn)物8 μL，在2.0%瓊脂糖凝膠中電泳，采用TAE電泳緩沖系統(tǒng)，9 V/cm恒壓電泳，DNA Marker 2000作為對照。電泳后Goldview染色，于凝膠成像儀下觀察電泳結(jié)果。②Sau3AⅠ酶切鑒定。取PCR產(chǎn)物電泳，回收其中的DNA片段，進(jìn)行Sau3AⅠ酶切，于2.5%瓊脂糖凝膠中電泳鑒定。

1.3.5 PCR擴增產(chǎn)物測序 將PCR擴增的產(chǎn)物經(jīng)凝膠回收純化，交由上海生工生物工程有限公司進(jìn)行測序。序列校對后，在GenBank中進(jìn)行BLAST比對分析驗證所得片段是否為所需要片段。

1.3.6 特異性試驗 取已制備的羊、馬、狗、驢、兔等15種動物肉的DNA各0.1μg作為模板，加入體系中進(jìn)行擴增，同時設(shè)立陰、陽性對照，電泳鑒定。

1.3.7 靈敏性試驗 將制備的生羊肉、熟羊肉和高壓羊肉的DNA模板依次做10倍遞增稀釋，直到1×10-12，每個稀釋濃度各取2 μL作為模板，進(jìn)行PCR擴增，同時設(shè)立陰、陽性對照，電泳鑒定。

1.3.8 市售肉制品的羊源性成分檢測 購置市售生羊肉40份、熟羊肉43份，提取其總DNA，用建立的PCR方法檢測其羊源性成分。

2 結(jié)果與分析

2.1 PCR方法的建立

以生鮮羊肉、熟羊肉和高壓羊肉所提取的DNA為模板進(jìn)行PCR擴增，均能得到295 bp的目的DNA條帶，與預(yù)期片段大小一致（圖1）。

2.2 PCR產(chǎn)物的酶切鑒定結(jié)果

取PCR產(chǎn)物電泳，回收其中的DNA片段，進(jìn)行Sau3AⅠ酶切，獲得的204 bp和91 bp片段，與預(yù)期片段大小一致（圖2）。

2.3 PCR擴增產(chǎn)物測序結(jié)果

將所得片段回收、克隆、測序、校對后，在NCBI中經(jīng) BLAST比對分析， 結(jié)果表明，羊源性成分DNA片段的核苷酸序列與GenBank中已登記的Ovis aries的基因序列的相似性均大于99%，證明所得片段均為目的片段（圖3）。

2.4 特異性試驗結(jié)果

以建立的肉制品中羊源性成分的PCR檢測方法分別對羊、馬、狗、驢、兔等15種動物肉的DNA進(jìn)行擴增，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，運用該引物對馬、狗、驢、兔等14種動物肉的DNA擴增均呈陰性（圖4）。

2.5 敏感性試驗結(jié)果

將制備的生鮮羊肉、熟羊肉和高壓羊肉的DNA模板不同稀釋度為模板的擴增結(jié)果表明，當(dāng)反應(yīng)體系中含羊源性成分全基因組DNA 0.225 pg時，經(jīng)過30個循環(huán)的擴增，電泳后可在紫外燈下見到明顯的擴增目的條帶（圖5）。

2.6 市售肉制品的羊源性成分檢測結(jié)果

使用本研究建立的PCR方法對市售的83份羊肉制品中羊源性成分進(jìn)行檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，羊源性陽性數(shù)量為83份，陽性檢出率為100%。

3 小結(jié)與討論

有相關(guān)研究表明，肉在熱加工過程中，DNA會發(fā)生降解，其長度在120 ℃時會銳減至600 bp以下[7]，因此，選擇了擴增長度為295 bp短片段，以避免出現(xiàn)假陰性結(jié)果。試驗結(jié)果表明，利用羊源性引物擴增出的產(chǎn)物，經(jīng)電泳與Marker相比較，并經(jīng)Sau3AⅠ內(nèi)切酶酶切鑒定和序列比對后，確實與預(yù)期的DNA片段大小一致，用該引物可以進(jìn)行生熟羊肉基因組DNA的擴增，且擴增產(chǎn)物一致，而其他14種動物肉DNA則無任何擴增效果。在試驗中，確定PCR鑒定羊肉的靈敏度達(dá)0.225 pg DNA，其敏感度較核酸探針雜交鑒定肉種類高5×104倍。運用本方法對市售的83份生熟羊肉制品進(jìn)行鑒定，檢測準(zhǔn)確率達(dá)100%，同時還對這83份樣品做了鴨和豬源性成分的檢測，發(fā)現(xiàn)有摻假現(xiàn)象，原因是一些不法企業(yè)和個人使用廉價的鴨肉或豬肉代替價格較高的羊肉進(jìn)行銷售，從中牟取高額利潤，同時鴨肉的紋理與羊肉更為相似，使得相應(yīng)的摻假更具有隱蔽性，可以逃脫相關(guān)部門的監(jiān)管。

PCR方法以其快速、靈敏、操作簡單、節(jié)省費用等特點逐漸成為質(zhì)檢部門檢測的主要手段，與其他動物DNA沒有交叉反應(yīng)，特異性強[8]。使用本試驗中的引物對肉制品進(jìn)行定性分析足以滿足市場檢測的要求，同時該法也為將來對肉制品中各源性成分含量定量檢測奠定基礎(chǔ)[9]。肉制品中羊源性成分PCR檢測方法著重解決了肉類，尤其是熟肉、熟肉制品的種類鑒定問題，克服了傳統(tǒng)方法由于蛋白質(zhì)變性而失能的困難，使肉種類鑒定達(dá)到一個新的階段，可為更好地保護人們的利益和進(jìn)一步落實食品質(zhì)量安全市場準(zhǔn)入制度提供技術(shù)保障[10]。

參考文獻(xiàn)：

[1] 王麗媛.PCR技術(shù)在肉類品種鑒別中的應(yīng)用研究[D].北京：中國農(nóng)業(yè)大學(xué).2006.

[2] MCOORMICK R J， COLLINS D A， FIELD R A， et al. Identification of meat from game and domestic species[J]. Journal of Food Science， 1992， 57（2）： 516-520.

[3] 范麗麗，李 培，傅春玲，等.實時熒光聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)法檢測食品中豬源性成分[J].食品科學(xué)，2013，34（8）：224-227.

[4] 劉帥帥，李 宏，羅世芝，等.PCR技術(shù)在肉類摻假檢驗中的應(yīng)用進(jìn)展[J].食品安全質(zhì)量檢測學(xué)報，2011，2（6）：280-284.

[5] 鄭明光，張國利，周志江，等.聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）鑒定馬肉方法的建立及應(yīng)用[J].肉品衛(wèi)生，1997（7）：6-8.

[6] 何瑋玲，張 馳，黃 明.食品中肉類成分種屬鑒別技術(shù)研究進(jìn)展[J].食品科學(xué)，2012，33（3）：304-307.

[7] EBBEHJ K F， THOMSEN P D. Species differentiation of heated meat products by DNA hybridization[J]. Meat Science， 1990， 30（3）： 221-234.

[8] 韓敏義，康明麗.PCR在肉類科學(xué)中的應(yīng)用[J].畜牧與飼料科學(xué)，2009，30（9）：57-60.

[9] 孫艷華，張智禹，牛晉陽，等.PCR法快速檢測熟肉制品中肉類來源[J].食品研究與開發(fā)，2010，31（5）：139-142.

[10] 鞏紅霞，任永宏，鞏 強.用多重PCR方法鑒定生羊肉的真假[J].中國畜牧獸醫(yī)，2006，33（8）：38-39.

1.3 試驗方法

1.3.1 引物設(shè)計與合成 根據(jù)GenBank中羊源性特異性DNA引物序列，利用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計合成一對特異性羊源引物。引物用高壓滅菌后的去離子水溶解并配制成100 mol/L的儲備液。引物序列：上游引物序列為5-TATTAGGCCTCCCCCTTGTT-3；下游引物序列為5-CCCTGCTCATAAGGGAATAGCC-3。引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。

1.3.2 樣品DNA的提取 取絞碎的羊、馬、狗、驢、兔等15種動物生鮮肉及熟羊肉和高壓羊肉，按照血液/細(xì)胞/組織基因組DNA提取試劑盒說明書提取模板DNA。取適量模板DNA，使用核酸蛋白分析儀或紫外分光光度計分別檢測260和280 nm處的吸光值A(chǔ)260和A280。A260/A280比值為1.7～1.9，適宜于PCR擴增。

1.3.3 PCR擴增 PCR反應(yīng)體系為50 μL，各成分含量為：10×PCR反應(yīng)緩沖液5 μL，25 mmol/L MgCl2 溶液3.0 μL，2.5 mmol/L 4×dNTPs 4.0 μL，引物sheepF和sheepR（25 μmol/L）各1.0 μL，DNA 模板1.0 μL，Taq DNA聚合酶1 U，無菌去離子水31.0 μL，混勻后離心，在PCR儀上開始循環(huán)。循環(huán)參數(shù)為：95 ℃預(yù)變性3 min，95 ℃變性60 s，56 ℃退火60 s，72 ℃延伸60 s，30個循環(huán)。72 ℃延伸5 min。最后4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.4 PCR產(chǎn)物鑒定 ①電泳鑒定。取擴增產(chǎn)物8 μL，在2.0%瓊脂糖凝膠中電泳，采用TAE電泳緩沖系統(tǒng)，9 V/cm恒壓電泳，DNA Marker 2000作為對照。電泳后Goldview染色，于凝膠成像儀下觀察電泳結(jié)果。②Sau3AⅠ酶切鑒定。取PCR產(chǎn)物電泳，回收其中的DNA片段，進(jìn)行Sau3AⅠ酶切，于2.5%瓊脂糖凝膠中電泳鑒定。

1.3.5 PCR擴增產(chǎn)物測序 將PCR擴增的產(chǎn)物經(jīng)凝膠回收純化，交由上海生工生物工程有限公司進(jìn)行測序。序列校對后，在GenBank中進(jìn)行BLAST比對分析驗證所得片段是否為所需要片段。

1.3.6 特異性試驗 取已制備的羊、馬、狗、驢、兔等15種動物肉的DNA各0.1μg作為模板，加入體系中進(jìn)行擴增，同時設(shè)立陰、陽性對照，電泳鑒定。

1.3.7 靈敏性試驗 將制備的生羊肉、熟羊肉和高壓羊肉的DNA模板依次做10倍遞增稀釋，直到1×10-12，每個稀釋濃度各取2 μL作為模板，進(jìn)行PCR擴增，同時設(shè)立陰、陽性對照，電泳鑒定。

1.3.8 市售肉制品的羊源性成分檢測 購置市售生羊肉40份、熟羊肉43份，提取其總DNA，用建立的PCR方法檢測其羊源性成分。

2 結(jié)果與分析

2.1 PCR方法的建立

以生鮮羊肉、熟羊肉和高壓羊肉所提取的DNA為模板進(jìn)行PCR擴增，均能得到295 bp的目的DNA條帶，與預(yù)期片段大小一致（圖1）。

2.2 PCR產(chǎn)物的酶切鑒定結(jié)果

取PCR產(chǎn)物電泳，回收其中的DNA片段，進(jìn)行Sau3AⅠ酶切，獲得的204 bp和91 bp片段，與預(yù)期片段大小一致（圖2）。

2.3 PCR擴增產(chǎn)物測序結(jié)果

將所得片段回收、克隆、測序、校對后，在NCBI中經(jīng) BLAST比對分析， 結(jié)果表明，羊源性成分DNA片段的核苷酸序列與GenBank中已登記的Ovis aries的基因序列的相似性均大于99%，證明所得片段均為目的片段（圖3）。

2.4 特異性試驗結(jié)果

以建立的肉制品中羊源性成分的PCR檢測方法分別對羊、馬、狗、驢、兔等15種動物肉的DNA進(jìn)行擴增，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，運用該引物對馬、狗、驢、兔等14種動物肉的DNA擴增均呈陰性（圖4）。

2.5 敏感性試驗結(jié)果

將制備的生鮮羊肉、熟羊肉和高壓羊肉的DNA模板不同稀釋度為模板的擴增結(jié)果表明，當(dāng)反應(yīng)體系中含羊源性成分全基因組DNA 0.225 pg時，經(jīng)過30個循環(huán)的擴增，電泳后可在紫外燈下見到明顯的擴增目的條帶（圖5）。

2.6 市售肉制品的羊源性成分檢測結(jié)果

使用本研究建立的PCR方法對市售的83份羊肉制品中羊源性成分進(jìn)行檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，羊源性陽性數(shù)量為83份，陽性檢出率為100%。

3 小結(jié)與討論

有相關(guān)研究表明，肉在熱加工過程中，DNA會發(fā)生降解，其長度在120 ℃時會銳減至600 bp以下[7]，因此，選擇了擴增長度為295 bp短片段，以避免出現(xiàn)假陰性結(jié)果。試驗結(jié)果表明，利用羊源性引物擴增出的產(chǎn)物，經(jīng)電泳與Marker相比較，并經(jīng)Sau3AⅠ內(nèi)切酶酶切鑒定和序列比對后，確實與預(yù)期的DNA片段大小一致，用該引物可以進(jìn)行生熟羊肉基因組DNA的擴增，且擴增產(chǎn)物一致，而其他14種動物肉DNA則無任何擴增效果。在試驗中，確定PCR鑒定羊肉的靈敏度達(dá)0.225 pg DNA，其敏感度較核酸探針雜交鑒定肉種類高5×104倍。運用本方法對市售的83份生熟羊肉制品進(jìn)行鑒定，檢測準(zhǔn)確率達(dá)100%，同時還對這83份樣品做了鴨和豬源性成分的檢測，發(fā)現(xiàn)有摻假現(xiàn)象，原因是一些不法企業(yè)和個人使用廉價的鴨肉或豬肉代替價格較高的羊肉進(jìn)行銷售，從中牟取高額利潤，同時鴨肉的紋理與羊肉更為相似，使得相應(yīng)的摻假更具有隱蔽性，可以逃脫相關(guān)部門的監(jiān)管。

PCR方法以其快速、靈敏、操作簡單、節(jié)省費用等特點逐漸成為質(zhì)檢部門檢測的主要手段，與其他動物DNA沒有交叉反應(yīng)，特異性強[8]。使用本試驗中的引物對肉制品進(jìn)行定性分析足以滿足市場檢測的要求，同時該法也為將來對肉制品中各源性成分含量定量檢測奠定基礎(chǔ)[9]。肉制品中羊源性成分PCR檢測方法著重解決了肉類，尤其是熟肉、熟肉制品的種類鑒定問題，克服了傳統(tǒng)方法由于蛋白質(zhì)變性而失能的困難，使肉種類鑒定達(dá)到一個新的階段，可為更好地保護人們的利益和進(jìn)一步落實食品質(zhì)量安全市場準(zhǔn)入制度提供技術(shù)保障[10]。

參考文獻(xiàn)：

[1] 王麗媛.PCR技術(shù)在肉類品種鑒別中的應(yīng)用研究[D].北京：中國農(nóng)業(yè)大學(xué).2006.

[2] MCOORMICK R J， COLLINS D A， FIELD R A， et al. Identification of meat from game and domestic species[J]. Journal of Food Science， 1992， 57（2）： 516-520.

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[4] 劉帥帥，李 宏，羅世芝，等.PCR技術(shù)在肉類摻假檢驗中的應(yīng)用進(jìn)展[J].食品安全質(zhì)量檢測學(xué)報，2011，2（6）：280-284.

[5] 鄭明光，張國利，周志江，等.聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）鑒定馬肉方法的建立及應(yīng)用[J].肉品衛(wèi)生，1997（7）：6-8.

[6] 何瑋玲，張 馳，黃 明.食品中肉類成分種屬鑒別技術(shù)研究進(jìn)展[J].食品科學(xué)，2012，33（3）：304-307.

[7] EBBEHJ K F， THOMSEN P D. Species differentiation of heated meat products by DNA hybridization[J]. Meat Science， 1990， 30（3）： 221-234.

[8] 韓敏義，康明麗.PCR在肉類科學(xué)中的應(yīng)用[J].畜牧與飼料科學(xué)，2009，30（9）：57-60.

[9] 孫艷華，張智禹，牛晉陽，等.PCR法快速檢測熟肉制品中肉類來源[J].食品研究與開發(fā)，2010，31（5）：139-142.

[10] 鞏紅霞，任永宏，鞏 強.用多重PCR方法鑒定生羊肉的真假[J].中國畜牧獸醫(yī)，2006，33（8）：38-39.

1.3 試驗方法

1.3.1 引物設(shè)計與合成 根據(jù)GenBank中羊源性特異性DNA引物序列，利用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計合成一對特異性羊源引物。引物用高壓滅菌后的去離子水溶解并配制成100 mol/L的儲備液。引物序列：上游引物序列為5-TATTAGGCCTCCCCCTTGTT-3；下游引物序列為5-CCCTGCTCATAAGGGAATAGCC-3。引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。

1.3.2 樣品DNA的提取 取絞碎的羊、馬、狗、驢、兔等15種動物生鮮肉及熟羊肉和高壓羊肉，按照血液/細(xì)胞/組織基因組DNA提取試劑盒說明書提取模板DNA。取適量模板DNA，使用核酸蛋白分析儀或紫外分光光度計分別檢測260和280 nm處的吸光值A(chǔ)260和A280。A260/A280比值為1.7～1.9，適宜于PCR擴增。

1.3.3 PCR擴增 PCR反應(yīng)體系為50 μL，各成分含量為：10×PCR反應(yīng)緩沖液5 μL，25 mmol/L MgCl2 溶液3.0 μL，2.5 mmol/L 4×dNTPs 4.0 μL，引物sheepF和sheepR（25 μmol/L）各1.0 μL，DNA 模板1.0 μL，Taq DNA聚合酶1 U，無菌去離子水31.0 μL，混勻后離心，在PCR儀上開始循環(huán)。循環(huán)參數(shù)為：95 ℃預(yù)變性3 min，95 ℃變性60 s，56 ℃退火60 s，72 ℃延伸60 s，30個循環(huán)。72 ℃延伸5 min。最后4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.4 PCR產(chǎn)物鑒定 ①電泳鑒定。取擴增產(chǎn)物8 μL，在2.0%瓊脂糖凝膠中電泳，采用TAE電泳緩沖系統(tǒng)，9 V/cm恒壓電泳，DNA Marker 2000作為對照。電泳后Goldview染色，于凝膠成像儀下觀察電泳結(jié)果。②Sau3AⅠ酶切鑒定。取PCR產(chǎn)物電泳，回收其中的DNA片段，進(jìn)行Sau3AⅠ酶切，于2.5%瓊脂糖凝膠中電泳鑒定。

1.3.5 PCR擴增產(chǎn)物測序 將PCR擴增的產(chǎn)物經(jīng)凝膠回收純化，交由上海生工生物工程有限公司進(jìn)行測序。序列校對后，在GenBank中進(jìn)行BLAST比對分析驗證所得片段是否為所需要片段。

1.3.6 特異性試驗 取已制備的羊、馬、狗、驢、兔等15種動物肉的DNA各0.1μg作為模板，加入體系中進(jìn)行擴增，同時設(shè)立陰、陽性對照，電泳鑒定。

1.3.7 靈敏性試驗 將制備的生羊肉、熟羊肉和高壓羊肉的DNA模板依次做10倍遞增稀釋，直到1×10-12，每個稀釋濃度各取2 μL作為模板，進(jìn)行PCR擴增，同時設(shè)立陰、陽性對照，電泳鑒定。

1.3.8 市售肉制品的羊源性成分檢測 購置市售生羊肉40份、熟羊肉43份，提取其總DNA，用建立的PCR方法檢測其羊源性成分。

2 結(jié)果與分析

2.1 PCR方法的建立

以生鮮羊肉、熟羊肉和高壓羊肉所提取的DNA為模板進(jìn)行PCR擴增，均能得到295 bp的目的DNA條帶，與預(yù)期片段大小一致（圖1）。

2.2 PCR產(chǎn)物的酶切鑒定結(jié)果

取PCR產(chǎn)物電泳，回收其中的DNA片段，進(jìn)行Sau3AⅠ酶切，獲得的204 bp和91 bp片段，與預(yù)期片段大小一致（圖2）。

2.3 PCR擴增產(chǎn)物測序結(jié)果

將所得片段回收、克隆、測序、校對后，在NCBI中經(jīng) BLAST比對分析， 結(jié)果表明，羊源性成分DNA片段的核苷酸序列與GenBank中已登記的Ovis aries的基因序列的相似性均大于99%，證明所得片段均為目的片段（圖3）。

2.4 特異性試驗結(jié)果

以建立的肉制品中羊源性成分的PCR檢測方法分別對羊、馬、狗、驢、兔等15種動物肉的DNA進(jìn)行擴增，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，運用該引物對馬、狗、驢、兔等14種動物肉的DNA擴增均呈陰性（圖4）。

2.5 敏感性試驗結(jié)果

將制備的生鮮羊肉、熟羊肉和高壓羊肉的DNA模板不同稀釋度為模板的擴增結(jié)果表明，當(dāng)反應(yīng)體系中含羊源性成分全基因組DNA 0.225 pg時，經(jīng)過30個循環(huán)的擴增，電泳后可在紫外燈下見到明顯的擴增目的條帶（圖5）。

2.6 市售肉制品的羊源性成分檢測結(jié)果

使用本研究建立的PCR方法對市售的83份羊肉制品中羊源性成分進(jìn)行檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，羊源性陽性數(shù)量為83份，陽性檢出率為100%。

3 小結(jié)與討論

有相關(guān)研究表明，肉在熱加工過程中，DNA會發(fā)生降解，其長度在120 ℃時會銳減至600 bp以下[7]，因此，選擇了擴增長度為295 bp短片段，以避免出現(xiàn)假陰性結(jié)果。試驗結(jié)果表明，利用羊源性引物擴增出的產(chǎn)物，經(jīng)電泳與Marker相比較，并經(jīng)Sau3AⅠ內(nèi)切酶酶切鑒定和序列比對后，確實與預(yù)期的DNA片段大小一致，用該引物可以進(jìn)行生熟羊肉基因組DNA的擴增，且擴增產(chǎn)物一致，而其他14種動物肉DNA則無任何擴增效果。在試驗中，確定PCR鑒定羊肉的靈敏度達(dá)0.225 pg DNA，其敏感度較核酸探針雜交鑒定肉種類高5×104倍。運用本方法對市售的83份生熟羊肉制品進(jìn)行鑒定，檢測準(zhǔn)確率達(dá)100%，同時還對這83份樣品做了鴨和豬源性成分的檢測，發(fā)現(xiàn)有摻假現(xiàn)象，原因是一些不法企業(yè)和個人使用廉價的鴨肉或豬肉代替價格較高的羊肉進(jìn)行銷售，從中牟取高額利潤，同時鴨肉的紋理與羊肉更為相似，使得相應(yīng)的摻假更具有隱蔽性，可以逃脫相關(guān)部門的監(jiān)管。

PCR方法以其快速、靈敏、操作簡單、節(jié)省費用等特點逐漸成為質(zhì)檢部門檢測的主要手段，與其他動物DNA沒有交叉反應(yīng)，特異性強[8]。使用本試驗中的引物對肉制品進(jìn)行定性分析足以滿足市場檢測的要求，同時該法也為將來對肉制品中各源性成分含量定量檢測奠定基礎(chǔ)[9]。肉制品中羊源性成分PCR檢測方法著重解決了肉類，尤其是熟肉、熟肉制品的種類鑒定問題，克服了傳統(tǒng)方法由于蛋白質(zhì)變性而失能的困難，使肉種類鑒定達(dá)到一個新的階段，可為更好地保護人們的利益和進(jìn)一步落實食品質(zhì)量安全市場準(zhǔn)入制度提供技術(shù)保障[10]。

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