陳麗冰+程薇+高虹+范秀芝+史德芳+吳光旭

摘要：為實(shí)現(xiàn)北蟲草[Cordyceps militaris（L.Fr.）Link]培養(yǎng)基的高效利用，采用閃式提取技術(shù)從北蟲草培養(yǎng)基中提取多糖。通過單因素試驗(yàn)考察了閃式提取的液料比、提取時(shí)間、轉(zhuǎn)速對提取效果的影響，利用正交試驗(yàn)法，優(yōu)化了北蟲草培養(yǎng)基中多糖提取的工藝。結(jié)果表明，提取時(shí)間和轉(zhuǎn)速對多糖提取效果有顯著影響，最佳提取工藝為液料比35∶1（mL∶g），提取時(shí)間12 min，轉(zhuǎn)速8 000 r/min。在該條件下，閃式提取多糖得率為3.52%，略高于傳統(tǒng)熱水回流提取的得率，且只需在室溫下進(jìn)行，提取時(shí)間大大縮短，說明閃式提取是一種快速有效提取北蟲草培養(yǎng)基中多糖的方法。

關(guān)鍵詞：北蟲草[Cordyceps militaris（L.Fr.）Link]；多糖；閃式提??；正交試驗(yàn)

中圖分類號(hào)：R284.2 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：0439-8114（2014）19-4670-05

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2014.19.043

Flash Extraction of Polysaccharide from Cordyceps militaris（L.Fr.）Link Medium

CHEN Li-bing1，2， CHENG Wei2， GAO Hong2， FAN Xiu-zhi2，SHI De-fang2， WU Guang-xu1

（1. College of Life Science， Yangtze University， Jingzhou 434025， Hubei， China；2. Institute of Agri-Products Processing and

Nuclear-Agricultural Technology， Hubei Academy of Agricultural Sciences， Wuhan 430064， China）

Abstract： In order to effecntively utilize the Cordyceps militaris（L.Fr.）Link medium， flash extraction was used to extract polysaccharide from C. militaris（L.Fr.）Link medium. The effects of liquid to material ratio， extraction time and rotation rate on the extraction rate were investigated with single factor tests. The extraction conditions were optimized with orthogonal design. Results shouved that both extraction time and rotation rate had significant effects on the extraction of polysaccharide. The optimal extraction condition was： liquid to material ratio of 35∶1（mL∶g）， extracting 12 min and centrifuging at 8 000 r/min. Under the optimal conditions， the extraction rate was 3.52%， slightly higher than the traditional hot water refluxing extraction. The extraction process was carried out at room temperature， and the time was greatly reduced. It is indicated that flash extraction can be used as a rapid and effective method to extract polysaccharide from C. militaris（L.Fr.）Link medium.

Key words： Cordyceps militaris（L.Fr.）Link； polysaccharide； flash extraction； orthogonal test

北蟲草[Cordyceps militaris（L.Fr.）Link]，又名北冬蟲夏草、蛹蟲草[1]，屬于真菌門（Eumycota）蟲草屬（Cordyceps）[2]。北蟲草與中藥冬蟲夏草有相似的藥理活性，蟲草多糖是其最重要的有效成分之一，具有降血糖、降血脂、抗炎、抗腫瘤、增強(qiáng)免疫等多種活性，且對機(jī)體無毒性[3-6]。近年來，研究者嘗試用大米、小麥等作為培養(yǎng)基來人工培育北蟲草子實(shí)體，為北蟲草有效成分的研究與應(yīng)用提供原料，但子實(shí)體采收后，長滿菌絲體的固體培養(yǎng)殘基的利用卻鮮有報(bào)道[7]。研究表明，北蟲草固體培養(yǎng)殘基中蟲草素的含量約為5‰，總糖含量為21.93%，蛋白質(zhì)仍達(dá)10%左右（比培養(yǎng)前高2.1%），蟲草多糖含量為12.86%，還含有生物堿、萜類化合物、甾醇、苷類、酚類、酶、維生素等有效成分[8]。因此，從北蟲草殘留培養(yǎng)基中提取蟲草多糖，具有廣泛的應(yīng)用前景。

目前多糖提取常用的方法有熱水浸提[9]、超聲提取[10]和微波輔助提取[11]等。熱水浸提操作簡便，是常見的使用方法，但該方法提取時(shí)間長、提取率低，長時(shí)間高溫還可能引起多糖的分解、氧化[12]。超聲波法提取時(shí)間短、提取率高，但當(dāng)超聲功率過大時(shí)，也會(huì)導(dǎo)致分子的裂解，進(jìn)而降低得率；微波法可將提取時(shí)間縮短到10 min以內(nèi)，同時(shí)由于微波的極性選擇性，在多糖得率增加的基礎(chǔ)上，使其純度也有所提高[13]。但微波的穿透深度不夠，在設(shè)備工藝放大后，其效能急劇下降，而且還面臨微波泄漏的問題，因此工業(yè)化應(yīng)用不廣泛。閃式提取法是一種提取天然產(chǎn)物的新技術(shù)，該方法是在室溫和適當(dāng)溶劑條件下，利用高速剪切力和攪拌力將植物原料粉碎至細(xì)微顆粒，并在局部負(fù)壓滲透作用下使有效成分迅速分散達(dá)到溶解平衡[14]。與傳統(tǒng)浸提方法相比，閃式提取法具有快速、高效、完全、節(jié)能等優(yōu)點(diǎn)[15]。目前，該方法已開始在植物有效成分提取中應(yīng)用[16-18]，但將其應(yīng)用于蟲草多糖的提取未見報(bào)道。本研究采用閃式提取法對北蟲草培養(yǎng)基中的蟲草多糖進(jìn)行了提取試驗(yàn)，在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，通過正交試驗(yàn)獲得最佳提取工藝，以期為北蟲草培養(yǎng)基中多糖提取的深入研究和開發(fā)利用提供理論和技術(shù)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

北蟲草培養(yǎng)基：由陽新新冠生態(tài)農(nóng)業(yè)開發(fā)有限公司提供，培養(yǎng)基以大米為主；α-淀粉酶（酶活為3 700 U/g），北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司；98%濃硫酸、苯酚、葡萄糖、95%乙醇、無水乙醇等，國藥集團(tuán)，均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

JHBE-50T型閃式提取器，河南金鼐科技發(fā)展有限公司；RE-52型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，上海亞榮生化儀器廠；LXJ-IIB型離心機(jī)，上海安亭科學(xué)儀器廠；TYSP-200型高速萬能粉碎機(jī)，浙江省永康市紅太陽機(jī)電有限公司；T6型紫外可見分光光度計(jì)，北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；HJ-6A型多頭磁力加熱攪拌器，常州國華電器有限公司；CS101-1E型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱，重慶四達(dá)試驗(yàn)設(shè)備有限公司；JA2003B型電子天平，上海越平科學(xué)儀器有限公司；XH-C型漩渦振蕩器，常州市國立試驗(yàn)設(shè)備研究所。

1.3 方法

1.3.1 繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線 按照NY/T 1676—2008的方法測定[19]，略有改動(dòng)。

精確稱取105 ℃干燥至恒重的無水葡萄糖0.100 0 g于100 mL燒杯中，用去離子水溶解并定容至1 000 mL，此時(shí)標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖工作液終濃度為0.1 g/L，置于4 ℃冰箱貯存。分別精確吸取葡萄糖液0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6 mL于20 mL具塞試管中，用去離子水補(bǔ)至1.0 mL。試液中加入1 mL 50 g/L的苯酚溶液，然后快速加入5 mL濃硫酸，靜置10 min。使用漩渦振蕩器使反應(yīng)液充分混合，然后將試管放置于30 ℃水浴中反應(yīng)20 min，采用紫外分光光度計(jì)于波長490 nm處測定吸光度，以濃度為橫坐標(biāo)，吸光度值為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.3.2 多糖的測定 將北蟲草培養(yǎng)基置于電熱恒溫干燥箱，60 ℃烘干至恒重后粉碎過20 mm孔徑篩。采用苯酚硫酸法測定多糖得率。精確稱取樣品50 mg，用去離子水溶解并定容至100 mL，搖勻。精確吸取0.2 mL樣液，加入0.8 mL蒸餾水，后續(xù)步驟同“1.3.1”，同時(shí)做空白，每組平行做3組。多糖濃度按照回歸方程進(jìn)行計(jì)算。多糖得率計(jì)算公式如下：

X1=■×100%

式中：X1為蟲草培養(yǎng)基多糖得率（%）；C為所得蟲草多糖質(zhì)量濃度（mg/mL）；V為蟲草多糖樣品液體積（mL）；M為烘干后培養(yǎng)基粉末取樣量（g）；N為稀釋倍數(shù)；m1為蟲草多糖烘干質(zhì)量（g）；m0為烘干后蟲草粗多糖取樣量（mg）。

1.3.3 熱水回流提取蟲草培養(yǎng)基中多糖 分別取25 g蟲草培養(yǎng)基粉末于2個(gè)圓底燒瓶中，料液比1∶30（g∶mL），90 ℃回流3 h，4 000 r/min離心10 min，上清液置于燒杯中，殘?jiān)M(jìn)行以上操作得上清液，合并上清液，旋蒸濃縮到一定體積，其中一個(gè)樣品直接加入5倍體積的95%乙醇，于4 ℃冰箱中靜置過夜。另一個(gè)按以下條件先將淀粉酶解（相關(guān)參數(shù)經(jīng)預(yù)試驗(yàn)優(yōu)化）：0.5 g α-淀粉酶，60 ℃，pH 為6，時(shí)間為3 h。酶解后再加入5倍體積的95%乙醇，于4 ℃冰箱中靜置過夜。次日取出醇析液4 000 r/min離心10 min，棄上清液，沉淀用適量無水乙醇洗滌，后放入60 ℃烘箱中烘干至恒重。將烘干的樣品稱量，取其中0.05 g用蒸餾水溶解并定容至100 mL。按照“1.3.2”的方法在490 nm處測定吸光度值，同時(shí)做空白，每組平行做3組，計(jì)算北蟲草培養(yǎng)基中多糖含量。

1.3.4 單因素試驗(yàn)

1）液料比對提取北蟲草培養(yǎng)基中多糖得率的影響。分別稱取25 g烘干的蟲草培養(yǎng)基粉末，在不同液料比20∶1、25∶1、30∶1、35∶1（mL∶g，下同）條件下，于閃式提取器中，以相同轉(zhuǎn)速8 000 r/min提取8 min，離心后對殘?jiān)僦貜?fù)操作一次，合并上清液，然后將提取液用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮至約100 mL，加入0.5 g α-淀粉酶，在pH 6，60 ℃下磁力攪拌酶解3 h，最后加入5倍體積的95%乙醇醇沉，靜置過夜。次日再離心，用無水乙醇洗滌沉淀兩次，放入烘箱中60 ℃烘干至恒重得蟲草粗多糖，用苯酚硫酸法測定多糖含量，計(jì)算多糖得率。

2）提取時(shí)間對提取北蟲草培養(yǎng)基中多糖得率的影響。分別稱取25 g烘干的蟲草培養(yǎng)基粉末，在液料比20∶1、轉(zhuǎn)速8 000 r/min的條件下分別提取4、6、8、10、12、14 min，步驟同上，計(jì)算多糖得率。

3）轉(zhuǎn)速對提取北蟲草培養(yǎng)基中多糖得率的影響。分別稱取25 g烘干的蟲草培養(yǎng)基粉末，以不同的轉(zhuǎn)速4 000、6 000、8 000、10 000 r/min，于閃式提取器中在液料比20∶1下提取8 min，步驟同上，計(jì)算多糖得率。

1.3.5 正交試驗(yàn) 以蟲草多糖得率為指標(biāo)，根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，利用正交試驗(yàn)對工藝參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化?？疾旄饕蛩貙μ崛”毕x草培養(yǎng)基中多糖得率的影響，確定考察的因素為液料比、提取時(shí)間、轉(zhuǎn)速。每因素選取3個(gè)水平，按照L9（34）正交試驗(yàn)進(jìn)行設(shè)計(jì)，各因素與水平如表1所示。

試驗(yàn)數(shù)據(jù)用極差法和方差分析法進(jìn)行分析，以確定北蟲草培養(yǎng)基中多糖閃式提取的最佳參數(shù)條件。

2 結(jié)果與分析

2.1 葡萄糖溶液的標(biāo)準(zhǔn)曲線

繪制葡萄糖溶液的標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖1所示，得到其回歸方程Y=13.465X+0.006（R2=0.999 6），標(biāo)準(zhǔn)曲線線性關(guān)系良好。

2.2 熱水回流提取蟲草多糖結(jié)果

從表2可知，北蟲草大米培養(yǎng)基提取液中不添加α-淀粉酶和添加α-淀粉酶時(shí)，前者所得蟲草多糖得率是后者的2.42倍，可能是北蟲草培養(yǎng)基中還殘存大量的淀粉，若不添加α-淀粉酶去除樣品中的淀粉將造成多糖得率虛高，使得到的結(jié)果不準(zhǔn)確。根據(jù)預(yù)試驗(yàn)優(yōu)化淀粉的最佳酶解工藝，在此條件下，基本排除了蟲草多糖測定中淀粉的干擾，使得試驗(yàn)結(jié)果更加準(zhǔn)確可信。

2.3 單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.3.1 液料比對北蟲草培養(yǎng)基中多糖提取的影響 由圖2可知，隨著液料比的變大，傳質(zhì)推動(dòng)力不斷提高，促進(jìn)了活性成分在水中的溶解和擴(kuò)散，從而提高了活性成分的得率[20]，即多糖得率隨之增加。液料比在20∶1～30∶1時(shí)，多糖得率增大的幅度較快；當(dāng)液料比大于30∶1時(shí)，多糖得率呈下降趨勢。這是由于溶劑用量的增加可以提高北蟲草培養(yǎng)基粉末與提取溶劑的接觸面積，增大固液濃度差，有利于擴(kuò)散速度的提高[21]，但當(dāng)液料比達(dá)到一定程度時(shí)，傳質(zhì)推動(dòng)力不再提高，因此，繼續(xù)增加液料比，固液濃度差增幅不太明顯，從而多糖得率增速變緩，過多的提取溶劑反而會(huì)使多糖得率降低。因此，選擇提取的液料比為30∶1。

2.3.2 提取時(shí)間對北蟲草培養(yǎng)基中多糖提取的影響 由圖3可知，在閃式提取12 min內(nèi)，北蟲草培養(yǎng)基中多糖得率隨時(shí)間的增加明顯升高，在12 min 時(shí)多糖得率達(dá)到最大值，隨著作用時(shí)間的延長，多糖得率有所降低。這可能是在閃提過程中由于刀頭剪切力的長時(shí)間作用，使培養(yǎng)基組織充分粉碎，產(chǎn)生過細(xì)的粉末使濾餅層致密，影響了多糖的濾出，使多糖提取效果降低。因此，選擇提取時(shí)間為12 min。

2.3.3 轉(zhuǎn)速對北蟲草培養(yǎng)基中多糖提取的影響 由圖4可知，當(dāng)電機(jī)轉(zhuǎn)速從4 000 r/min增加到6 000 r/min的過程中，北蟲草培養(yǎng)基中多糖得率隨著轉(zhuǎn)速的提高而增加，這是因?yàn)殚W式提取器的轉(zhuǎn)數(shù)越高，越有利于培養(yǎng)基的粉碎、細(xì)胞組織的破壞和溶質(zhì)向溶劑的擴(kuò)散，從而促進(jìn)溶質(zhì)的浸出和溶解[22]。當(dāng)轉(zhuǎn)速達(dá)到6 000 r/min時(shí)多糖得率達(dá)到最大值，而隨后增加轉(zhuǎn)速，多糖得率反而降低。這可能是因?yàn)殚W式提取器的電機(jī)轉(zhuǎn)速加快，造成溶液劇烈翻滾，溶液局部溫度過高，多糖的結(jié)構(gòu)發(fā)生變化或遭到破壞，從而使多糖提取效果降低。因此，選擇閃提的轉(zhuǎn)速為6 000 r/min。

2.4 正交試驗(yàn)

正交試驗(yàn)和方差分析結(jié)果見表3、表4。從表3可知，影響北蟲草培養(yǎng)基中多糖得率的各因素的主次順序?yàn)镃、B、A，即轉(zhuǎn)速影響最大，其次是提取時(shí)間，影響最小的是液料比。方差分析結(jié)果（表4）表明，閃式提取的提取時(shí)間和轉(zhuǎn)速對北蟲草培養(yǎng)基中多糖的提取具有顯著影響（P<0.05）。在試驗(yàn)設(shè)計(jì)范圍內(nèi)，得到閃式提取北蟲草培養(yǎng)基中多糖的優(yōu)化工藝條件為A3B2C3。

2.5 驗(yàn)證試驗(yàn)

按照優(yōu)化工藝條件進(jìn)行3次平行試驗(yàn)，得到多糖得率平均值為3.52%，高于單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)的結(jié)果，故確定北蟲草培養(yǎng)基中多糖提取的最佳工藝條件為液料比35∶1，提取時(shí)間12 min，轉(zhuǎn)速8 000 r/min。在此條件下，對閃式提取與傳統(tǒng)熱水回流的效果進(jìn)行了比較（表5）。由表5可知，閃式提取多糖的得率略高于熱水回流提取，但與熱水回流提取相比，閃式提取只需在室溫（25 ℃）下進(jìn)行，有效避免了長時(shí)間高溫提取對多糖結(jié)構(gòu)的破壞，且提取時(shí)間由180 min縮短為12 min，節(jié)省了能耗，提高了效率。

3 小結(jié)

本研究將閃式提取法應(yīng)用于北蟲草培養(yǎng)基中多糖的提取，試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)提取時(shí)間和轉(zhuǎn)速對北蟲草培養(yǎng)基中多糖提取具有顯著影響，通過正交試驗(yàn)得到最佳提取工藝為液料比35∶1，提取時(shí)間12 min，轉(zhuǎn)速8 000 r/min，多糖得率為3.52%。由于本試驗(yàn)所用蟲草培養(yǎng)基原料為大米，所以培養(yǎng)基中殘存的大量淀粉會(huì)干擾蟲草多糖的測定，因此試驗(yàn)中添加α-淀粉酶以去除淀粉，排除干擾，使所得結(jié)果更為準(zhǔn)確。與傳統(tǒng)提取方法相比，閃式提取具有快速、高效、簡單、節(jié)能的特點(diǎn)。

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