田知海，茅云翔，孔凡娜，李 超，張曉楠，徐奎鵬

（中國(guó)海洋大學(xué)海洋生命學(xué)院，山東 青島 266003）

條斑紫菜（Pyropiayezoensis）屬紅藻門(mén)（Rhodophyta）、紅毛菜綱（Bangiophyceae）、紅毛藻目（Bangiales）、紅毛菜科（Bangiaceae）、紫菜屬（Pyropia/Porphyra）。條斑紫菜由于其重要的經(jīng)濟(jì)價(jià)值而被大規(guī)模栽培，同時(shí)該物種也是潮間帶藻類(lèi)的模式物種，是開(kāi)展抗逆分子機(jī)理研究的理想材料［1－2］。組織破碎是DNA制備的首要步驟，不同的破碎方法對(duì)制備效率和DNA質(zhì)量有顯著影響。目前，制備條斑紫菜DNA采用的組織破碎方法有：液氮研磨、石英砂研磨、海螺酶制備原生質(zhì)體和LiCl軟化紫菜組織4種方法［3－4］。液氮和石英砂研磨能有效的破碎紫菜組織，但耗費(fèi)時(shí)間長(zhǎng)、效率低；另外2種方法的優(yōu)點(diǎn)是能夠減少紫菜中豐富的多糖對(duì)DNA質(zhì)量的影響，但同樣操作時(shí)間較長(zhǎng)。上述方法均不適合于大批量樣品的DNA制備，同時(shí)也難以保障所制備DNA質(zhì)量的均一性。近年來(lái)，條斑紫菜群體遺傳多樣性、品系鑒定等方面的研究不斷增多［5－9］，在SSR、AFLP和轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究中需要高效率、質(zhì)量均一的DNA制備方法。

生物樣品均質(zhì)器采用“珠間碰撞技術(shù)”研磨樣品，能有效的研磨破碎不同材質(zhì)（細(xì)菌、骨頭等）的樣品提取DNA［10－11］。對(duì)樣品快速、強(qiáng)力的研磨不僅節(jié)約時(shí)間、提高DNA得率，而且可同時(shí)制備數(shù)十個(gè)樣品，避免了交叉污染，極大提高了DNA制備效率［12－13］。但是對(duì)于不同樣品，最佳研磨條件（研磨介質(zhì)、研磨時(shí)間、研磨速度）是不同的。本實(shí)驗(yàn)使用Precellys 24生物樣品均質(zhì)器，通過(guò)比較DNA得率、純度、完整性以及PCR應(yīng)用、限制性酶酶切效果等指標(biāo)，優(yōu)化建立了1套高效率制備條斑紫菜葉狀體高質(zhì)量DNA的技術(shù)方法。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 生物樣品材料 新鮮材料：收集條斑紫菜葉狀體，吸水紙吸干表面水分，每50mg分裝成1份備用。干燥材料：將上述方法收集的50mg新鮮材料在60℃下烘干3h，烘干后質(zhì)量約為10mg。

1.1.2 器材和試劑

主要器材 Precellys 24生物樣品均質(zhì)器（法國(guó)Bertin）、恒溫水浴鍋、冰箱、天平、高速冷凍離心機(jī)、穩(wěn)壓電泳儀、凝膠成像系統(tǒng)、紫外分光光度計(jì)、PCR儀。研磨介質(zhì)：鋼珠（Φ2.3mm）、陶瓷珠（Φ1mm）、玻璃珠（Φ0.5 mm）。上述3種研磨珠均購(gòu)自上海奧然科貿(mào)有限公司；石英砂（0.270～0.707mm），購(gòu)自上海國(guó)藥集團(tuán)。

試劑 提取緩沖液：100mol/L Tris-HCl、50mol/L EDTA、500mol/L NaCl，pH＝8.0；SDS溶液：20%W/V溶于無(wú)菌蒸餾水；蛋白酶K儲(chǔ)存液：20mg蛋白酶K溶于1mL超純水中，－20℃凍存；RNase A：10mg/mL，－20℃凍存；異丙醇：－20℃使用；乙醇：75%V/V，－20℃使用；TE溶液：10mmol/L Tris-HCl，1mmol/L EDTA，pH＝8.0。

1.2 方法

1.2.1 均質(zhì)研磨設(shè)計(jì)

1.2.1.1 不同介質(zhì)類(lèi)型長(zhǎng)時(shí)間處理 預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示均質(zhì)80s時(shí)，鋼珠對(duì)新鮮和干燥材料的破碎效果與液氮研磨相近，因此選用80s為研磨時(shí)間，對(duì)不同介質(zhì)類(lèi)型、介質(zhì)體積和材料類(lèi)型（新鮮材料、干燥材料）進(jìn)行了條件優(yōu)化（見(jiàn)表1）。共24個(gè)實(shí)驗(yàn)處理，每個(gè)處理設(shè)置3個(gè)平行。

干燥材料和研磨介質(zhì)共同均質(zhì)破碎，破碎完成后加入1mL提取緩沖液；新鮮材料中加入1mL提取緩沖液與研磨介質(zhì)共同均質(zhì)破碎。均質(zhì)條件為：轉(zhuǎn)速6 800r/min，時(shí)間20s/次，均質(zhì)4次。

表1 長(zhǎng)時(shí)間處理?xiàng)l件下的研磨介質(zhì)類(lèi)型和體積Table 1 Bead types and volumes for long time granding（80s）

1.2.1.2 以鋼珠為介質(zhì)不同的處理時(shí)間 實(shí)驗(yàn)過(guò)程中發(fā)現(xiàn)均質(zhì)80s時(shí)，鋼珠對(duì)材料的破碎效果最好，能夠有效提取DNA，260/280比值符合要求，260/230比值較穩(wěn)定，但存在DNA降解的問(wèn)題。組織細(xì)胞的有效破碎是提取核酸的前提。因此，本實(shí)驗(yàn)又探索了以鋼珠為均質(zhì)介質(zhì)，不同均質(zhì)時(shí)間的DNA制備效果，均質(zhì)時(shí)間為5、10、20、40s。樣品為干燥、新鮮2種，鋼珠體積為0.2mL，轉(zhuǎn)速為6 800r/min，每個(gè)處理設(shè)3個(gè)重復(fù)。

1.2.2 藻體破碎效果 樣品均質(zhì)處理完成后，用移液器取100μL均質(zhì)液，在顯微鏡下觀察、測(cè)量并拍照。每個(gè)研磨樣品隨機(jī)選擇3個(gè)視野，每個(gè)視野統(tǒng)計(jì)6個(gè)碎片長(zhǎng)度，碎片長(zhǎng)度以碎片長(zhǎng)軸的長(zhǎng)度計(jì)，每個(gè)研磨樣品共記錄18個(gè)數(shù)據(jù)。

1.2.3 DNA提取過(guò)程 DNA制備參照 Wattier的紅藻DNA提取方法［14］，進(jìn)行適當(dāng)修改。具體操作如下：

加入1mL提取緩沖液的EP管中，加入100μL SDS（20%W/V）、5μL蛋白酶 K（20mg/mL），混合均勻放入37℃恒溫水浴鍋中溫浴30min，每5min劇烈振蕩一次；16 200g，4℃離心15min，取上清約800μL移入新EP管中冰浴30min；16 200g，4℃離心15min，取上清加入0.7倍體積異丙醇（－20℃），輕輕混勻后－20℃過(guò)夜；16 200g，4℃離心30min。棄上清；加入1mL 75%（V/V）冷乙醇（－20℃）洗滌沉淀，8 600g，4℃下離心10min，上述洗滌過(guò)程重復(fù)3次；棄上清，沉淀風(fēng)干至無(wú)乙醇?xì)埩?；加?00μL TE溶液37℃溶解DNA。8 600g，4℃離心10min，取上清即為DNA溶液。加入1μL RNase A（10mg/mL），37℃水浴1h。－20℃保存。

1.2.4 DNA質(zhì)量及應(yīng)用性檢測(cè)

1.2.4.1 DNA得率和純度 用Nanodrop微量光度計(jì)測(cè)定DNA溶液在260、230、280nm的光吸收值，并測(cè)算260/280、260/230值和DNA濃度（ng/μL）。

DNA得率（μg/g）＝DNA濃度（ng/μL）×DNA體積（μL）/（樣品質(zhì)量0.05g×1 000）。

1.2.4.2 DNA完整性檢測(cè) 1%瓊脂糖凝膠電泳，DNA上樣量為500ng。90V，30min穩(wěn)壓電泳，EB染色15min。凝膠成像系統(tǒng)拍照保存。

1.2.4.3 DNA應(yīng)用性檢測(cè)

PCR擴(kuò)增 以制備的基因組DNA作為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)，驗(yàn)證DNA產(chǎn)物是否可以應(yīng)用于PCR擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)。目的基因?yàn)閷?shí)驗(yàn)室開(kāi)發(fā)的SSR分子標(biāo)記，目的片段為242bp。正向引物primer1序列為（5’-ACCTGTCAATGTCTTCAACCAC）、反向引物primer2序列為（5’-TCAGTCTGGGATGTGTCGAG）。PCR體系為20μL：2×Mix 10μL、ddw 6.6μL、primer1（10μmol/L）0.6μL、primer2（10μmol/L）0.6μL、DNA（20ng/μL）1μL、BSA（10mg/mL）1 μL、Taq DNA聚合酶（2.5U/μL）0.2μL。PCR反應(yīng)程序：94℃預(yù)變性5min，35個(gè)循環(huán)（94℃30s、59℃30s、72℃45s），72℃10min，10℃永久保存。PCR產(chǎn)物用2%瓊脂糖凝膠電泳，Marker為50bp ladder。電泳條件為95V，30min。EB染色15min，凝膠成像系統(tǒng)拍照保存。

DNA限制性?xún)?nèi)切酶酶切 對(duì)基因組DNA產(chǎn)物使用限制性?xún)?nèi)切酶進(jìn)行酶切，檢驗(yàn)DNA制備條件對(duì)酶切是否有影響。分別用限制性?xún)?nèi)切酶TaqI和PstI進(jìn)行酶切。酶切體系：1μg DNA樣品、2μL H buffer（10×）、2μLTaqI（10U/μL）或2μLPstI（15U/μL）、去離子水補(bǔ)足20μL。TaqI酶切條件：65℃8h，10℃保存；PstI酶切條件：37℃8h，65℃15min，10℃保存。取10μL酶切產(chǎn)物用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)酶切效果，EB染色15min，凝膠成像系統(tǒng)拍照。

2 結(jié)果與分析

2.1 破碎效果

2.1.1 不同介質(zhì)類(lèi)型長(zhǎng)時(shí)間處理 研磨80s時(shí)，不同體積的研磨介質(zhì)對(duì)樣品破碎效果基本一致；不同的研磨介質(zhì)對(duì)樣品破碎的效果有明顯的差異，鋼珠破碎效果最好，其次是陶瓷珠，最差的是玻璃珠；干燥材料和新鮮材料破碎程度有差別（見(jiàn)圖1）。

圖1 不同研磨介質(zhì)研磨干燥、新鮮材料破碎程度Fig.1 Fresh and dried samples grinded by different types of beads

干燥材料中，鋼珠能將紫菜葉狀體全部破碎成100μm以下的碎片；陶瓷珠組材料沒(méi)有完全破碎，破碎的碎片長(zhǎng)度集中在100～400μm之間；石英砂和玻璃珠組中葉狀體基本沒(méi)有破碎，石英砂組中破碎的碎片長(zhǎng)度100μm左右，玻璃珠組中沒(méi)有葉狀體碎片存在。新鮮材料中，鋼珠和陶瓷珠將紫菜葉狀體全部打碎，碎片長(zhǎng)度在100μm以下；石英砂和玻璃珠組中葉狀體樣品基本沒(méi)有破碎，石英砂組破碎的材料碎片長(zhǎng)度在100μm左右；玻璃珠組破碎的材料碎片長(zhǎng)度一般在200μm左右。

2.1.2 鋼珠為均質(zhì)介質(zhì)處理不同時(shí)間 在5、10、20、40s4個(gè)時(shí)間梯度下，鋼珠均能有效的破碎干燥材料和新鮮材料。干燥材料在研磨5～40s內(nèi)破碎效果一直。新鮮材料在研磨5～40s內(nèi)，碎片長(zhǎng)度隨著研磨時(shí)間的增長(zhǎng)顯著性減小。干燥材料5s時(shí)的碎片長(zhǎng)度集中在100～150μm之間；新鮮材料破碎5s時(shí)，碎片長(zhǎng)度集中在800～1 000μm之間，見(jiàn)圖2。40s時(shí)碎片長(zhǎng)度集中在200～300μm。

2.2 DNA完整性

2.2.1 不同介質(zhì)類(lèi)型長(zhǎng)時(shí)間處理 研磨80s時(shí)，研磨介質(zhì)的體積對(duì)DNA產(chǎn)物完整性沒(méi)有顯著性影響。石英砂和玻璃珠組研磨干燥材料所得DNA完整性最好，4種研磨介質(zhì)研磨新鮮材料所得DNA出現(xiàn)降解，鋼珠和陶瓷珠組研磨干燥材料所得DNA基本全部降解，完整性最差（見(jiàn)圖3）。

圖2 鋼珠研磨5s后材料碎片F(xiàn)ig.2 The fractions of samples grinded with metal beads at 5s

圖3 80s研磨處理制備DNA電泳圖譜Fig.3 Agarose gel electrophoresis of DNA extracted by grinding 80s

2.2.2 鋼珠為均質(zhì)介質(zhì)處理不同時(shí)間 在5、10、20、40s4個(gè)時(shí)間梯度下，利用鋼珠破碎的樣品能制備出完整性很好的DNA。干燥、新鮮2種樣品材料對(duì)DNA的完整性沒(méi)有顯著性影響。分子量21kb處各樣品間條帶基本相同；4kb處我們認(rèn)為可能是質(zhì)體和線粒體基因組DNA，隨著研磨時(shí)間延長(zhǎng)這條帶不斷減弱。所以認(rèn)為鋼珠均質(zhì)5s時(shí)，干燥和新鮮材料制備的DNA完整性最好（見(jiàn)圖4）。

2.3 DNA得率與純度

2.3.1 不同介質(zhì)類(lèi)型長(zhǎng)時(shí)間處理 研磨80s時(shí)，鋼珠、陶瓷珠研磨新鮮材料和玻璃珠研磨干燥材料時(shí)DNA得率隨著研磨介質(zhì)體積的增加有所增加，其他組DNA得率和研磨介質(zhì)體積關(guān)系不明顯。干燥材料在不同研磨介質(zhì)之間DNA得率沒(méi)有明顯差異；新鮮材料在不同研磨介質(zhì)之間DNA得率存在顯著性差異。鋼珠和陶瓷珠研磨時(shí)，新鮮材料DNA得率高于干燥材料DNA得率；石英砂和玻璃珠研磨時(shí)，新鮮材料DNA得率低于干燥材料DNA得率。干燥材料DNA得率集中在300～400μg/g之間；新鮮材料DNA得率由鋼珠、陶瓷珠、石英砂和玻璃珠依次減?。ㄒ?jiàn)圖5）。

圖4 鋼珠處理不同時(shí)間制備DNA電泳圖Fig.4 Agarose gel electrophoresis of DNA extracted by metal beads with different grinding time

實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，研磨介質(zhì)體積差異與260/280值沒(méi)有顯著的相關(guān)性；260/230值隨著鋼珠和陶瓷珠體積的增加有所增加，隨著玻璃珠體積的增加有所減小，與石英砂體積沒(méi)有一定的正負(fù)相關(guān)性。

新鮮材料和干燥材料制備DNA的純度存在差異，鋼珠和陶瓷珠組中新鮮材料制備的DNA其260/280和260/230值均大于干燥材料制備的DNA；石英砂組新鮮材料制備的DNA其260/280小于干燥材料制備的DNA；玻璃珠組新鮮材料和干燥材料制備的DNA其260/280和260/230大小隨體積的變化而變化。

不同的研磨介質(zhì)所得DNA其260/280比值在1.8～2.0之間，說(shuō)明蛋白質(zhì)被有效去除；石英砂研磨新鮮材料和玻璃珠研磨干燥材料所得DNA其260/230值大于2.0，多糖被有效去除；其余組260/230值在1.0～1.5之間，存在多糖污染。石英砂和玻璃珠不能有效的破碎樣品，可能影響后續(xù)的實(shí)驗(yàn)操作，使多糖不能被穩(wěn)定的除去，造成DNA中多糖含量存在較大的差異（見(jiàn)表2）。

圖5 介質(zhì)類(lèi)型和介質(zhì)體積對(duì)DNA得率的影響Fig.5 Effect of types and volume of beads on DNA yield

2.3.2 鋼珠為均質(zhì)介質(zhì)處理不同時(shí)間 在5、10、20、40s4個(gè)時(shí)間梯度下，利用鋼珠破碎的樣品均能制備出DNA。干燥材料隨著鋼珠研磨時(shí)間的延長(zhǎng)，DNA得率有所增加；新鮮材料隨著鋼珠研磨時(shí)間的延長(zhǎng)，DNA得率沒(méi)有明顯變化。干燥材料在不同研磨時(shí)間下所得DNA純度基本一致，260/280值在1.8左右，260/230值在0.8～1.2之間；新鮮材料在不同研磨時(shí)間所得DNA純度基本一致，260/280值在1.8左右，260/230值在0.9～1.2之間。260/280比值平均值在1.8左右，說(shuō)明DNA中蛋白質(zhì)被有效去除，DNA純度較高。260/230比值平均值在0.8～1.2之間，說(shuō)明DNA中存在多糖等物質(zhì)污染（見(jiàn)表3）。

2.4 PCR檢測(cè)

2.4.1 不同介質(zhì)類(lèi)型長(zhǎng)時(shí)間處理 研磨80s時(shí)制備的DNA，PCR擴(kuò)增的產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳。結(jié)果（見(jiàn)圖6）顯示所有條件下制備的DNA均能擴(kuò)增出目的DNA片段。

2.4.2 鋼珠為均質(zhì)介質(zhì)處理不同時(shí)間 以鋼珠均質(zhì)5～40s制備的DNA為模塊，PCR反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，結(jié)果（見(jiàn)圖7）顯示所有干燥材料和新鮮材料在5～40s研磨時(shí)間下制備的DNA均能擴(kuò)增出目的DNA片段。

2.5 DNA限制性?xún)?nèi)切酶酶切

鋼珠研磨5～40s時(shí)制備的DNA，能被限制性?xún)?nèi)切酶TaqI和PstI有效酶切（見(jiàn)圖8）。

表2 介質(zhì)類(lèi)型和介質(zhì)體積對(duì)DNA純度的影響Table 2 Effect of types and volume of beads on the purity of DNA

表3 DNA純度與得率Table 3 Purity and yield of DNA

圖6 PCR產(chǎn)物電泳圖Fig.6 Agarose gel electrophoresis of PCR amplification

圖7 PCR產(chǎn)物電泳圖Fig.7 Agarose gel electrophoresis of PCR amplification

3 討論

3.1 材料破碎效果與DNA得率

在研磨時(shí)間為80s時(shí)，干燥材料破碎效果最好的是鋼珠，最差的是玻璃珠。但是不同研磨介質(zhì)對(duì)干燥材料DNA的得率沒(méi)有顯著性影響，鋼珠研磨干燥材料時(shí)DNA得率為368μg/g，玻璃珠研磨干燥材料時(shí)DNA得率為352μg/g。原因是石英砂和玻璃珠在研磨干材料時(shí)，雖然沒(méi)有將干燥材料有效的破碎，但是高速的研磨過(guò)程中研磨介質(zhì)和樣品材料不斷碰撞，破壞了樣品材料細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)使DNA釋放出來(lái)。所以樣品材料沒(méi)有完全破碎沒(méi)有影響DNA得率。

3.2 影響DNA完整性的因素

圖8 DNA酶切產(chǎn)物電泳圖Fig.8 Electrophoresis of genomic DNA digested with Pst I and TaqI endonuclease

在進(jìn)行不同介質(zhì)類(lèi)型長(zhǎng)時(shí)間處理試驗(yàn)中，從DNA的完整性講，石英砂和玻璃珠研磨干燥材料所得DNA完整性最好，4種研磨介質(zhì)研磨新鮮材料所得DNA都出現(xiàn)了嚴(yán)重的降解，鋼珠和陶瓷珠研磨干燥材料所得DNA降解最為嚴(yán)重。分析原因可能是干燥材料在石英砂和玻璃珠破碎時(shí)，雖然破壞了細(xì)胞壁的結(jié)構(gòu)，但是DNA沒(méi)有立刻釋放出來(lái)，減少了DNA與研磨介質(zhì)碰撞的機(jī)會(huì)，所以DNA完整性較好；而鋼珠和陶瓷珠因?yàn)槊芏却?，研磨干燥材料時(shí)時(shí)作用力強(qiáng)，將樣品打碎的同時(shí)也會(huì)將DNA打斷，影響了DNA完整性；而新鮮材料研磨時(shí)隨著樣品細(xì)胞結(jié)構(gòu)的破壞，DNA被釋放到提取液中，因此研磨介質(zhì)的碰撞可以將DNA打斷成小的片段；但同時(shí)因?yàn)镈NA釋放到了溶液中，減小了研磨介質(zhì)對(duì)DNA的剪切力，所以DNA完整性比鋼珠和陶瓷珠研磨干燥材料時(shí)DNA降解程度小。

本方法利用Precellys 24高速介質(zhì)儀短時(shí)間研磨樣品，其優(yōu)點(diǎn)是：處理量大（每次24個(gè)樣品），處理時(shí)間短，樣品之間平行性好，樣品間無(wú)交叉污染。由于減少了樣品的損耗，同時(shí)有效破碎了樣品，所以DNA得率高。DNA得率在400～500μg/g之間，是其他研磨方法DNA得率的2～8倍［3－4］。同時(shí)，本方法5s就能對(duì)24個(gè)樣品進(jìn)行有效的破碎，與液氮每5～10min研磨一個(gè)樣品相比，大大提高了工作效率。

4 結(jié)語(yǔ)

利用4種研磨介質(zhì)、干燥和新鮮2種樣品材料、不同的研磨時(shí)間，優(yōu)化了條斑紫菜葉狀體DNA制備的方法。作者認(rèn)為破碎干燥和新鮮2種樣品材料制備高質(zhì)量條斑紫菜DNA的最佳條件為：研磨介質(zhì)為0.2mL鋼珠、研磨速度為6 800r/min、研磨時(shí)間為5s。

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