王津果，隋正紅，周 偉，常連鵬，張 淑，馬金華，張學(xué)成

（中國海洋大學(xué)海洋生物遺傳學(xué)與育種教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東 青島 266003）

龍須菜是一種重要的產(chǎn)瓊膠海藻，瓊膠含量可達(dá)干重的20%～30%，所產(chǎn)瓊膠量是世界瓊膠總產(chǎn)量的53%［1－2］。龍須菜由于含有豐富的營養(yǎng)物質(zhì)而成為人們喜愛的海洋蔬菜，也可廣泛用作鮑魚餌料［3］。龍須菜還具有生長快速、適應(yīng)環(huán)境能力強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)，并能有效地吸收N、P，防止水體富營養(yǎng)化，改善水質(zhì)［4］。另外，我們可以在實(shí)驗(yàn)室內(nèi)培養(yǎng)并完成其生活史，且可能在任何時(shí)間得到四分孢子和果孢子，龍須菜還是進(jìn)行遺傳學(xué)研究的理想材料［5］。

中國江蘺的栽培可以追溯到1950年代［6］；1970年代中國探索出了江蘺的半人工育苗技術(shù)；1980年代龍須菜的浮筏栽培研究取得巨大成功［7］，并提出了龍須菜南移栽培思路；1990年代龍須菜南移栽培示范養(yǎng)殖成功，栽培面積逐年提高，尤其是1998年龍須菜耐高溫品種981培育成功，極大地促進(jìn)了栽培業(yè)和相應(yīng)產(chǎn)業(yè)的發(fā)展［8］。本世紀(jì)龍須菜栽培業(yè)發(fā)展更為迅速，成為中國繼海帶和紫菜之后的第三大海藻栽培業(yè)，栽培面積超過13 333萬m2，平均年產(chǎn)鮮重高達(dá)10萬t，產(chǎn)值過億。

近年來，受海區(qū)惡劣環(huán)境的影響，龍須菜栽培過程中出現(xiàn)的問題日益嚴(yán)重，栽培品系的一些優(yōu)良性狀正逐步退化［9－11］。由于環(huán)境條件可加強(qiáng)、加速江蘺營養(yǎng)藻體的遺傳改變，導(dǎo)致同一藻體形態(tài)特征和生長響應(yīng)的差異，且單一的種質(zhì)不能適應(yīng)和滿足所有海區(qū)環(huán)境及需求［12－14］。據(jù)2006年《中國漁業(yè)統(tǒng)計(jì)年鑒》統(tǒng)計(jì)，全國江蘺栽培規(guī)模已達(dá)5 266hm2，年產(chǎn)量達(dá)98 563t鮮品，2007年龍須菜產(chǎn)量相比2006年減產(chǎn)了5.9%，栽培面積僅為2006年的63.5%。因此種質(zhì)改良與良種選育是維持龍須菜產(chǎn)業(yè)化發(fā)展的重要一環(huán)。孟琳等［15］以981為出發(fā)藻株，通過亞硝基胍誘變和耐羥脯氨酸篩選，選育出龍須菜新品系07-2，并對其性狀進(jìn)行了分析，發(fā)現(xiàn)其在生長速度、抗逆性以及與瓊膠代謝有關(guān)的α－半乳糖苷酶活性方面均比981更具優(yōu)勢。

本實(shí)驗(yàn)室采用優(yōu)勢株選育的策略，結(jié)合采孢子育苗技術(shù)，于2010年10月培育出龍須菜新品系ZC，并在青島市膠州灣養(yǎng)殖海區(qū)進(jìn)行栽培試驗(yàn)。在近3年的培育期間ZC表現(xiàn)出優(yōu)良的生產(chǎn)性狀，如藻體顏色鮮紅、長度長、分枝多、生長快速、雜藻附生少、抗逆性強(qiáng)等，具有推廣潛力。

SCAR （Sequence Characterized Amplified Regions，序列特征化擴(kuò)增區(qū)）標(biāo)記被廣泛應(yīng)用于一些形態(tài)上難以區(qū)分而且經(jīng)濟(jì)價(jià)值差異較大的種和品種鑒別及種質(zhì)評(píng)價(jià)［16］。由于龍須菜新品系ZC與栽培品系981、07-2在外觀形態(tài)上很難區(qū)分，因此本研究通過分析981、07-2、ZC以及湛山灣野生四分孢子體的 RSAP［17］（Restriction Site Amplified Polymorphism，限制性位點(diǎn)擴(kuò)增多態(tài)性）指紋圖譜，旨在篩選獲得ZC的特異條帶，并將其轉(zhuǎn)化為穩(wěn)定可靠、特異性高的SCAR標(biāo)記，利用該特異標(biāo)記將龍須菜新品系ZC與其他龍須菜材料區(qū)分開來，可應(yīng)用于產(chǎn)業(yè)品系分子鑒定。

本文還在實(shí)驗(yàn)室條件下比較了ZC與981、07-2、湛山灣野生四分孢子體的生物量累積速率、線性生長速度及色素含量等生理生化參數(shù)，進(jìn)一步證實(shí)ZC具有某些優(yōu)良特性，并獲得其SCAR分子標(biāo)記，以期為龍須菜新品系ZC的推廣應(yīng)用提供科學(xué)理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與處理

龍須菜新品系ZC、栽培品系981與07-2于2010年10月采自青島膠州灣養(yǎng)殖海區(qū)；湛山灣野生四分孢子體于2010年10月采自青島湛山灣，將采回的野生藻株切片置于顯微鏡下觀察，在皮層細(xì)胞中分布有呈十字形分裂的四分孢子囊的即為四分孢子體［18］。

在海水中用消毒毛刷除掉藻株表面附著的雜藻和泥砂后，無菌海水沖洗3次，置于滅菌、加Pro培養(yǎng)基［19］的海水中，在光強(qiáng)40～50μmol·m－2·s－1、光周期12L∶12D、溫度23℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每周更換1次新鮮培養(yǎng)基。

1.2 數(shù)量性狀的測定

1.2.1 生物量累積速率的測定 參考程曉杰等［20］的方法，每個(gè)樣品取1g的鮮重藻體，1 000mL三角瓶中充氣培養(yǎng)，每3d更換1次新鮮培養(yǎng)基，2周后測定每個(gè)樣品的鮮重；重新切回藻體鮮重1g，重復(fù)2次，取3次測量結(jié)果的平均值，單位以%/d表示。

1.2.2 線性生長速度的測量 參考程曉杰等［20］的方法，每個(gè)樣品取20個(gè)長度2cm幼嫩藻尖置于培養(yǎng)皿中培養(yǎng)，每周更換新鮮培養(yǎng)基，2周后測定長度，將所有分枝計(jì)入總長；切回2cm長，重復(fù)2次，取平均值，單位以mm/d表示。

1.2.3 藻紅蛋白（PE）含量的測定 藻株在實(shí)驗(yàn)室經(jīng)2周培養(yǎng)后，參照林貞賢等［21］的提取方法和達(dá)維斯［22］的計(jì)算公式，依據(jù)測定的吸光值和公式計(jì)算出PE的含量，每個(gè)樣品設(shè)3個(gè)平行，取平均值，單位以mg/g鮮重藻體表示。

1.2.4 葉綠素a（Chla）含量的測定 Chla的提取和計(jì)算公式參照Moran［23］的方法，依據(jù)測定的吸光值和公式計(jì)算出Chla的含量，每個(gè)樣品設(shè)3個(gè)平行，取平均值。

1.2.5 總蛋白質(zhì)含量的測定 藻株在實(shí)驗(yàn)室經(jīng)2周培養(yǎng)后，濾紙吸干表面水分，稱取0.2g鮮重藻，在冰上研磨，離心，考馬斯亮藍(lán)法［24］測定總蛋白含量，每個(gè)樣品設(shè)3個(gè)平行，取平均值，單位用mg/g表示。

1.2.6 光合放氧和呼吸耗氧速率的測定 藻株在實(shí)驗(yàn)室經(jīng)2周培養(yǎng)后，濾紙吸干表面水分，稱取0.1g鮮重藻，切成小段，利用微呼吸測量系統(tǒng)，采用氧電極法［25］測定光合放氧和呼吸耗氧速率，每個(gè)樣品設(shè)3個(gè)平行，取平均值，單位為nmol O2·g－1FW·h－1。

1.3 統(tǒng)計(jì)分析

實(shí)驗(yàn)均設(shè)置3個(gè)平行樣，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差表示，用統(tǒng)計(jì)軟件SPSS 12.0對所得數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析和多重比較，顯著性水平為P＝0.05。

1.4 SCAR標(biāo)記的開發(fā)與驗(yàn)證

1.4.1 龍須菜基因組DNA的提取 采用天根植物基因組DNA提取試劑盒（TIANGEN BIOTECH，北京）提取3個(gè)981樣品，3個(gè)07-2樣品，3個(gè)ZC樣品及15株湛山灣野生四分孢子體共計(jì)24個(gè)龍須菜樣品的基因組DNA。

1.4.2 RSAP擴(kuò)增 RSAP-PCR的反應(yīng)體系與條件參考杜曉華等［17］的方法并作了適當(dāng)?shù)母倪M(jìn)。其中引物由上海生工技術(shù)有限公司合成，引物序列如表1。6個(gè)引物可分別與其它任何1個(gè)引物組合而得到15對引物，利用這15對引物對24個(gè)龍須菜樣品DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增。20μL PCR反應(yīng)體系中各反應(yīng)物含量：2μL10×PCR buffer，30ng基因組DNA，2.5mmol·L－1MgCl2，0.15mmol·L－1dNTP，0.4μmol·L－1引物，2UTaqDNA聚合酶。PCR反應(yīng)在杭州朗基96孔精品型PCR儀上進(jìn)行，反應(yīng)程序?yàn)椋?4℃預(yù)變性5min；94℃1min，35℃ 1min，72℃1min，5個(gè)循環(huán)；94℃1min，46℃1min，72℃1min，30個(gè)循環(huán)；72℃延伸5min，4℃保存。

15對引物在24個(gè)樣品中進(jìn)行RSAP擴(kuò)增，每對引物每個(gè)樣品的擴(kuò)增產(chǎn)物分別通過6%的變性聚丙烯酰胺凝膠電泳（Polyacrylamide Gel Electrophoresis，PAGE）分離，銀染后進(jìn)行分析［26］。

1.4.3 ZC特異條帶回收與測序 分析篩選PAGE板上出現(xiàn)的ZC特異條帶，參照Poly－gel DNA extraction kit說明進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠膠回收。將回收的目的片段進(jìn)行量的放大，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳后，按照TaKaRa Agarose Gel DNA Purification Kit說明書進(jìn)行瓊脂糖凝膠回收。目的片段按照pMD 18-T Vector說明書連接，轉(zhuǎn)入DH5α，經(jīng)過氨芐青霉素抗性篩選，挑取單菌落以PCR反應(yīng)檢測分子量，克隆產(chǎn)物由上海生工3730測序儀進(jìn)行單向測序。

1.4.4 SCAR引物的設(shè)計(jì)與驗(yàn)證 將去載體后序列進(jìn)行同源性比對。此外，將該序列載入軟件Primer Premier 5.0，在其兩端設(shè)計(jì)特異引物，并送上海生工合成。參照2.3.1提取981、07-2、ZC各2株和30株湛山灣野生四分孢子體的基因組DNA，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，1.5%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行目的片段的檢測。

表1 RSAP分析與SCAR驗(yàn)證所用的引物Table 1 Information of the primers used in RSAP analysis and SCAR verification

2 結(jié)果與分析

2.1 生物量累積速率和線性生長速度比較

圖1 4種不同龍須菜之間生物量累積速率和線性生長速度比較Fig.1 Comparison of biomass accumulation and linear growth rate among 4strains of G.lemaneiformis

生物量累積速率結(jié)果比較表明，不同來源的龍須菜顯示出較為明顯的差異。由圖1可知，栽培品系中，生物量累積速率最快的是9.50%/d的07-2，其次是8.99%/d的981，ZC則為8.80%/d，3者之間沒有顯著性差異；野生的最慢，僅為6.36%/d，并且顯著低于3個(gè)栽培品系。

從線性生長速度來看，不同來源的龍須菜差別較大。與生物量累積速率不同，栽培品系中，ZC的線性生長速度最快，達(dá)9.89mm/d，其次為8.48mm/d的981和6.52mm/d的07-2，統(tǒng)計(jì)分析3個(gè)栽培品系間具有顯著性差異；6.45mm/d的野生顯著低于3個(gè)栽培品系。

2.2 PE和Chl a含量比較

圖2 4種不同龍須菜之間藻紅蛋白和葉綠素a含量比較Fig.2 Comparison of phycoerythrin and chlorophyll acontents among 4strains of G.lemaneiformis

不同材料2種光合色素含量見圖2。以野生為參考標(biāo)準(zhǔn)，其PE與 Chla含量分別為3.53mg/g、1.94 mg/g，981的PE和Chla含量分別增加了7.4%和10.8%；07-2的色素含量相差幅度都較大，PE和Chla比野生高24.4%、49.0%；而ZC的PE含量比野生高9.3%，Chla則低2.6%。多重比較結(jié)果顯示，ZC的PE含量顯著低于07-2，與981無明顯不同，但顯著高于野生；ZC的Chla含量與野生沒有明顯不同，顯著低于栽培品系981、07-2。

2.3 總蛋白質(zhì)含量比較

由圖3可知，4種龍須菜的總蛋白質(zhì)含量呈現(xiàn)顯著性差異。其中，ZC的總蛋白質(zhì)含量最高，為7.21mg/g，顯著高于野生6.99mg/g及栽培品系6.80mg/g的981與6.36mg/g的07-2。

圖3 4種不同龍須菜之間總蛋白質(zhì)含量比較Fig.3 Comparison of total protein content among 4 strains of G.lemaneiformis

2.4 光合放氧和呼吸耗氧速率比較

由圖4可知，4種龍須菜的光合放氧速率從高到低依次為ZC（20 714.0nmol O2·g－1FW·h－1）＞981（20 382.5nmol O2·g－1FW·h－1）＞野生（15 832.5 nmol O2·g－1FW·h－1）＞07-2（13 122.7nmol O2·g－1FW·h－1）；呼吸耗氧速率最高的是ZC，為4 433.0 nmol O2·g－1FW·h－1，最低的是2 482.5nmol O2·g－1FW·h－1的野生，栽培品系981與07-2介于二者之間。多重比較結(jié)果顯示，4種龍須菜的光合放氧和呼吸耗氧速率并無明顯不同。

圖4 4種不同龍須菜之間光合放氧和呼吸耗氧速率比較Fig.4 Comparison of the rate of photosynthetic oxygen evolution and respiration oxygen consumption among 4strains of G.lemaneiformis

2.5 SCAR標(biāo)記的開發(fā)與驗(yàn)證

2.5.1 RSAP擴(kuò)增結(jié)果 24個(gè)個(gè)體、15對引物共擴(kuò)增出669個(gè)位點(diǎn)。RSAP擴(kuò)增結(jié)果的聚丙烯酰胺凝膠電泳情況見圖5。

圖5 龍須菜24個(gè)樣品RSAP擴(kuò)增結(jié)果的聚丙烯酰胺凝膠電泳圖示Fig.5 RSAP amplification result of 24samples of G.lemaneiformis resolved by PAGE analysis

2.5.2 ZC特異條帶的回收、測序以及SCAR引物設(shè)計(jì)與驗(yàn)證 將篩選得到的ZC特異條帶回收測序后，得到大小為726bp的片段。在序列兩端設(shè)計(jì)SCAR引物，引物信息見表1。SCAR2引物對981、07-2、ZC各2個(gè)樣品和30株湛山灣野生四分孢子體共計(jì)36個(gè)龍須菜樣品的基因組DNA擴(kuò)增結(jié)果見圖6，擴(kuò)增片段大小為680bp。結(jié)果表明，特異SCAR2引物對981與ZC基因組DNA都可以擴(kuò)增出預(yù)期大小的特異條帶，而在07-2和湛山灣野生四分孢子體中均無擴(kuò)增條帶。利用之前本實(shí)驗(yàn)室針對981的特異條帶設(shè)計(jì)的SCAR1引物（引物序列見表1）對ZC基因組DNA進(jìn)行了擴(kuò)增，發(fā)現(xiàn)在ZC中無擴(kuò)增條帶的出現(xiàn)。用SCAR1和SCAR2引物組合進(jìn)行基因組DNA擴(kuò)增，ZC品系具有不同于其它樣品的擴(kuò)增結(jié)果。結(jié)合這兩對SCAR引物達(dá)到對龍須菜新品系ZC進(jìn)行特異檢測的目的。

3 討論

龍須菜栽培品系981與07-2都是經(jīng)過誘變處理選育而來的，具有耐高溫、速生抗逆等優(yōu)良性狀［9，15］，自被選育出來一直都是生產(chǎn)上的苗種來源，為龍須菜產(chǎn)業(yè)的迅速發(fā)展提供了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。但是在生產(chǎn)實(shí)踐中，隨著時(shí)間的推移都逐漸出現(xiàn)了種質(zhì)退化的跡象。本實(shí)驗(yàn)室通過采孢子育苗和優(yōu)勢株選育相結(jié)合的方法，將野生藻體釋放的孢子（果孢子和四分孢子）采集到網(wǎng)簾上，通過水平掛養(yǎng)的方式養(yǎng)成，篩選出耐高溫、速生和抗逆性強(qiáng)的新品系ZC，測定了其一系列數(shù)量性狀，并與其他不同來源的龍須菜進(jìn)行了比較研究。

圖6 SCAR2引物對龍須菜新個(gè)體的驗(yàn)證PCR電泳圖Fig.6 Agarose gel profile of G.lemaneiformis individuals amplified with the SCAR2primer

有研究表明，江蘺藻體生物量累積速率、PE含量等參數(shù)易受外界環(huán)境因素的影響，如培養(yǎng)的條件、所用的培養(yǎng)基、試驗(yàn)所取樣品的部位等，甚至連藻體生長狀況都會(huì)影響到試驗(yàn)的結(jié)果［27］。因此，本試驗(yàn)在進(jìn)行生物量累積速率、線性生長速度以及色素含量等數(shù)量性狀的測定與測量時(shí)，盡量保持了培養(yǎng)條件的一致以及取樣部位的一致（如都盡量取三級(jí)分支），以確保本研究結(jié)果的準(zhǔn)確可靠。

龍須菜優(yōu)良品種的其中一個(gè)衡量參數(shù)是線性生長速度［15］。孟琳等［15］和陳偉洲［11］分 別將其 作為龍 須菜栽培品系07-2的篩選指標(biāo)以及對栽培品系07-2、07-1與981進(jìn)行比較的指標(biāo)。本研究結(jié)果顯示，ZC的線性生長速度顯著地高于栽培品系981、07-2及野生個(gè)體，顯示了其較好的產(chǎn)業(yè)開發(fā)價(jià)值。

PE位于藻膽體中，是紅藻中的主要輔助色素，起到將光能轉(zhuǎn)移到光合體系的反應(yīng)中心轉(zhuǎn)變?yōu)榛瘜W(xué)能的作用，是藻類光合作用能力的一個(gè)重要的衡量生理指標(biāo)［28－31］。另外在氮元素缺乏時(shí)PE還可以作為功能性儲(chǔ)存氮來合成其他的蛋白質(zhì)［32］。Chla是所有藻類中含量最豐富和最基本的光合色素［33］。許多環(huán)境因素如光波長、金屬離子與N、P濃度等都能夠影響植物光合色素的含量［28，34－35］。Xu等［36］研究了不同水深處（離海水表層的距離）龍須菜的光合色素含量，隨水深的增加色素含量增加，特定生長速率降低。Han等［37］認(rèn)為藻類把能量用在色素的合成上，而用在生長的能量減少，從而使生長受到抑制。有研究表明，龍須菜具有三級(jí)分枝，不同分枝色素含量不同，一級(jí)分枝色素含量高于二級(jí)分枝，三級(jí)分枝色素含量最低［38］。本研究結(jié)果表明，ZC的PE含量明顯低于07-2，與981無顯著性差異，但Chla含量顯著地低于2個(gè)栽培品系。作者在實(shí)驗(yàn)中也發(fā)現(xiàn)ZC的分支程度顯著高于981、07-2，這也許是導(dǎo)致其測定色素含量低的原因，而多分枝性狀可較好地滿足產(chǎn)業(yè)需求。

研究表明，龍須菜蛋白質(zhì)含量高，且必需氨基酸所占比例較高、種類齊全、比例也較適宜，是營養(yǎng)價(jià)值較高的蛋白質(zhì)資源［39］。另外，蛋白質(zhì)的含量在一定程度上反映了其體內(nèi)色素含量和酶水平［40］。通過比較來源不同的4個(gè)四分孢子體龍須菜，ZC的總蛋白含量顯著地高于2個(gè)栽培品系和野生藻株，可作為一種提供更高蛋白質(zhì)來源的鮑魚餌料使用［41］。

光合和呼吸作用是植物在生長過程中物質(zhì)和能量的來源，反映了代謝水平的高低。本試驗(yàn)通過測定光合放氧和呼吸耗氧速率來研究龍須菜的光合和呼吸作用。藻類只能利用自由CO2和HC，并且對溶解于水中的CO2有高親和力，對HC的親和力較低［42］，因此藻類的光合和呼吸速率易受水中無機(jī)碳含量［43－44］和pH［45］的影響。另有研究表明，江蘺屬紅藻的光合和呼吸速率還受到光強(qiáng)和光質(zhì)［46］、氮和氨濃度［47－48］的影響。本研究結(jié)果顯示ZC與目前的主要栽培品系981、07-2以及野生株在光合放氧和呼吸耗氧速率方面并無顯著性差異，表明ZC在光合和呼吸作用方面并未與其他龍須菜材料顯現(xiàn)出明顯不同。

SCAR標(biāo)記一般是由RAPD，AFLP等轉(zhuǎn)化而來，一般情況下，研究者均是在篩選得到某一樣品的特異條帶后再進(jìn)行這一工作［49］。由隨機(jī)標(biāo)記轉(zhuǎn)化為SCAR標(biāo)記，其成功的概率總體而言不是很高［50－52］。本研究中，對RSAP指紋圖譜進(jìn)行分析時(shí)篩選到了龍須菜新品系ZC區(qū)別于其他材料的特有條帶，但是在驗(yàn)證時(shí)對ZC和981基因組DNA都擴(kuò)增出了同樣大小的條帶。一方面是受電泳凝膠分辨率和引物結(jié)合位點(diǎn)特異性的影響；另一方面是因?yàn)樵谠O(shè)計(jì)引物時(shí)，只設(shè)計(jì)了一對引物組合，不可避免的影響了SCAR標(biāo)記轉(zhuǎn)化的成功率［49］。這同時(shí)也說明了SCAR標(biāo)記開發(fā)時(shí)驗(yàn)證試驗(yàn)的必要性。將此標(biāo)記與之前本實(shí)驗(yàn)室獲得的981的SCAR標(biāo)記結(jié)合使用，可以實(shí)現(xiàn)對新品系ZC特異、穩(wěn)定鑒定。

通過測定一系列的不同來源龍須菜材料的生長與生理生化參數(shù)，豐富了龍須菜數(shù)量性狀的數(shù)據(jù)，同時(shí)也可以看出新品系ZC相較現(xiàn)有的栽培品系具備一定的栽培優(yōu)勢。另外，利用分子手段獲得了能夠鑒定ZC的、可能與其優(yōu)良經(jīng)濟(jì)性狀相關(guān)的特異性條帶。通過對ZC進(jìn)行的生理生化及分子的相關(guān)研究工作，為龍須菜新品系ZC的后續(xù)推廣與應(yīng)用工作奠定一定的基礎(chǔ)。

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