王津果，隋正紅，周 偉，常連鵬，張 淑，馬金華，張學(xué)成

（中國海洋大學(xué)海洋生物遺傳學(xué)與育種教育部重點實驗室，山東 青島 266003）

龍須菜是一種重要的產(chǎn)瓊膠海藻，瓊膠含量可達(dá)干重的20%～30%，所產(chǎn)瓊膠量是世界瓊膠總產(chǎn)量的53%［1－2］。龍須菜由于含有豐富的營養(yǎng)物質(zhì)而成為人們喜愛的海洋蔬菜，也可廣泛用作鮑魚餌料［3］。龍須菜還具有生長快速、適應(yīng)環(huán)境能力強等優(yōu)點，并能有效地吸收N、P，防止水體富營養(yǎng)化，改善水質(zhì)［4］。另外，我們可以在實驗室內(nèi)培養(yǎng)并完成其生活史，且可能在任何時間得到四分孢子和果孢子，龍須菜還是進行遺傳學(xué)研究的理想材料［5］。

中國江蘺的栽培可以追溯到1950年代［6］；1970年代中國探索出了江蘺的半人工育苗技術(shù)；1980年代龍須菜的浮筏栽培研究取得巨大成功［7］，并提出了龍須菜南移栽培思路；1990年代龍須菜南移栽培示范養(yǎng)殖成功，栽培面積逐年提高，尤其是1998年龍須菜耐高溫品種981培育成功，極大地促進了栽培業(yè)和相應(yīng)產(chǎn)業(yè)的發(fā)展［8］。本世紀(jì)龍須菜栽培業(yè)發(fā)展更為迅速，成為中國繼海帶和紫菜之后的第三大海藻栽培業(yè)，栽培面積超過13 333萬m2，平均年產(chǎn)鮮重高達(dá)10萬t，產(chǎn)值過億。

近年來，受海區(qū)惡劣環(huán)境的影響，龍須菜栽培過程中出現(xiàn)的問題日益嚴(yán)重，栽培品系的一些優(yōu)良性狀正逐步退化［9－11］。由于環(huán)境條件可加強、加速江蘺營養(yǎng)藻體的遺傳改變，導(dǎo)致同一藻體形態(tài)特征和生長響應(yīng)的差異，且單一的種質(zhì)不能適應(yīng)和滿足所有海區(qū)環(huán)境及需求［12－14］。據(jù)2006年《中國漁業(yè)統(tǒng)計年鑒》統(tǒng)計，全國江蘺栽培規(guī)模已達(dá)5 266hm2，年產(chǎn)量達(dá)98 563t鮮品，2007年龍須菜產(chǎn)量相比2006年減產(chǎn)了5.9%，栽培面積僅為2006年的63.5%。因此種質(zhì)改良與良種選育是維持龍須菜產(chǎn)業(yè)化發(fā)展的重要一環(huán)。孟琳等［15］以981為出發(fā)藻株，通過亞硝基胍誘變和耐羥脯氨酸篩選，選育出龍須菜新品系07-2，并對其性狀進行了分析，發(fā)現(xiàn)其在生長速度、抗逆性以及與瓊膠代謝有關(guān)的α－半乳糖苷酶活性方面均比981更具優(yōu)勢。

本實驗室采用優(yōu)勢株選育的策略，結(jié)合采孢子育苗技術(shù)，于2010年10月培育出龍須菜新品系ZC，并在青島市膠州灣養(yǎng)殖海區(qū)進行栽培試驗。在近3年的培育期間ZC表現(xiàn)出優(yōu)良的生產(chǎn)性狀，如藻體顏色鮮紅、長度長、分枝多、生長快速、雜藻附生少、抗逆性強等，具有推廣潛力。

SCAR （Sequence Characterized Amplified Regions，序列特征化擴增區(qū)）標(biāo)記被廣泛應(yīng)用于一些形態(tài)上難以區(qū)分而且經(jīng)濟價值差異較大的種和品種鑒別及種質(zhì)評價［16］。由于龍須菜新品系ZC與栽培品系981、07-2在外觀形態(tài)上很難區(qū)分，因此本研究通過分析981、07-2、ZC以及湛山灣野生四分孢子體的 RSAP［17］（Restriction Site Amplified Polymorphism，限制性位點擴增多態(tài)性）指紋圖譜，旨在篩選獲得ZC的特異條帶，并將其轉(zhuǎn)化為穩(wěn)定可靠、特異性高的SCAR標(biāo)記，利用該特異標(biāo)記將龍須菜新品系ZC與其他龍須菜材料區(qū)分開來，可應(yīng)用于產(chǎn)業(yè)品系分子鑒定。

本文還在實驗室條件下比較了ZC與981、07-2、湛山灣野生四分孢子體的生物量累積速率、線性生長速度及色素含量等生理生化參數(shù)，進一步證實ZC具有某些優(yōu)良特性，并獲得其SCAR分子標(biāo)記，以期為龍須菜新品系ZC的推廣應(yīng)用提供科學(xué)理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與處理

龍須菜新品系ZC、栽培品系981與07-2于2010年10月采自青島膠州灣養(yǎng)殖海區(qū)；湛山灣野生四分孢子體于2010年10月采自青島湛山灣，將采回的野生藻株切片置于顯微鏡下觀察，在皮層細(xì)胞中分布有呈十字形分裂的四分孢子囊的即為四分孢子體［18］。

在海水中用消毒毛刷除掉藻株表面附著的雜藻和泥砂后，無菌海水沖洗3次，置于滅菌、加Pro培養(yǎng)基［19］的海水中，在光強40～50μmol·m－2·s－1、光周期12L∶12D、溫度23℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每周更換1次新鮮培養(yǎng)基。

1.2 數(shù)量性狀的測定

1.2.1 生物量累積速率的測定 參考程曉杰等［20］的方法，每個樣品取1g的鮮重藻體，1 000mL三角瓶中充氣培養(yǎng)，每3d更換1次新鮮培養(yǎng)基，2周后測定每個樣品的鮮重；重新切回藻體鮮重1g，重復(fù)2次，取3次測量結(jié)果的平均值，單位以%/d表示。

1.2.2 線性生長速度的測量 參考程曉杰等［20］的方法，每個樣品取20個長度2cm幼嫩藻尖置于培養(yǎng)皿中培養(yǎng)，每周更換新鮮培養(yǎng)基，2周后測定長度，將所有分枝計入總長；切回2cm長，重復(fù)2次，取平均值，單位以mm/d表示。

1.2.3 藻紅蛋白（PE）含量的測定 藻株在實驗室經(jīng)2周培養(yǎng)后，參照林貞賢等［21］的提取方法和達(dá)維斯［22］的計算公式，依據(jù)測定的吸光值和公式計算出PE的含量，每個樣品設(shè)3個平行，取平均值，單位以mg/g鮮重藻體表示。

1.2.4 葉綠素a（Chla）含量的測定 Chla的提取和計算公式參照Moran［23］的方法，依據(jù)測定的吸光值和公式計算出Chla的含量，每個樣品設(shè)3個平行，取平均值。

1.2.5 總蛋白質(zhì)含量的測定 藻株在實驗室經(jīng)2周培養(yǎng)后，濾紙吸干表面水分，稱取0.2g鮮重藻，在冰上研磨，離心，考馬斯亮藍(lán)法［24］測定總蛋白含量，每個樣品設(shè)3個平行，取平均值，單位用mg/g表示。

1.2.6 光合放氧和呼吸耗氧速率的測定 藻株在實驗室經(jīng)2周培養(yǎng)后，濾紙吸干表面水分，稱取0.1g鮮重藻，切成小段，利用微呼吸測量系統(tǒng)，采用氧電極法［25］測定光合放氧和呼吸耗氧速率，每個樣品設(shè)3個平行，取平均值，單位為nmol O2·g－1FW·h－1。

1.3 統(tǒng)計分析

實驗均設(shè)置3個平行樣，實驗數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差表示，用統(tǒng)計軟件SPSS 12.0對所得數(shù)據(jù)進行方差分析和多重比較，顯著性水平為P＝0.05。

1.4 SCAR標(biāo)記的開發(fā)與驗證

1.4.1 龍須菜基因組DNA的提取 采用天根植物基因組DNA提取試劑盒（TIANGEN BIOTECH，北京）提取3個981樣品，3個07-2樣品，3個ZC樣品及15株湛山灣野生四分孢子體共計24個龍須菜樣品的基因組DNA。

1.4.2 RSAP擴增 RSAP-PCR的反應(yīng)體系與條件參考杜曉華等［17］的方法并作了適當(dāng)?shù)母倪M。其中引物由上海生工技術(shù)有限公司合成，引物序列如表1。6個引物可分別與其它任何1個引物組合而得到15對引物，利用這15對引物對24個龍須菜樣品DNA進行PCR擴增。20μL PCR反應(yīng)體系中各反應(yīng)物含量：2μL10×PCR buffer，30ng基因組DNA，2.5mmol·L－1MgCl2，0.15mmol·L－1dNTP，0.4μmol·L－1引物，2UTaqDNA聚合酶。PCR反應(yīng)在杭州朗基96孔精品型PCR儀上進行，反應(yīng)程序為：94℃預(yù)變性5min；94℃1min，35℃ 1min，72℃1min，5個循環(huán)；94℃1min，46℃1min，72℃1min，30個循環(huán)；72℃延伸5min，4℃保存。

15對引物在24個樣品中進行RSAP擴增，每對引物每個樣品的擴增產(chǎn)物分別通過6%的變性聚丙烯酰胺凝膠電泳（Polyacrylamide Gel Electrophoresis，PAGE）分離，銀染后進行分析［26］。

1.4.3 ZC特異條帶回收與測序 分析篩選PAGE板上出現(xiàn)的ZC特異條帶，參照Poly－gel DNA extraction kit說明進行聚丙烯酰胺凝膠膠回收。將回收的目的片段進行量的放大，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳后，按照TaKaRa Agarose Gel DNA Purification Kit說明書進行瓊脂糖凝膠回收。目的片段按照pMD 18-T Vector說明書連接，轉(zhuǎn)入DH5α，經(jīng)過氨芐青霉素抗性篩選，挑取單菌落以PCR反應(yīng)檢測分子量，克隆產(chǎn)物由上海生工3730測序儀進行單向測序。

1.4.4 SCAR引物的設(shè)計與驗證 將去載體后序列進行同源性比對。此外，將該序列載入軟件Primer Premier 5.0，在其兩端設(shè)計特異引物，并送上海生工合成。參照2.3.1提取981、07-2、ZC各2株和30株湛山灣野生四分孢子體的基因組DNA，進行PCR擴增，1.5%瓊脂糖凝膠電泳進行目的片段的檢測。

表1 RSAP分析與SCAR驗證所用的引物Table 1 Information of the primers used in RSAP analysis and SCAR verification

2 結(jié)果與分析

2.1 生物量累積速率和線性生長速度比較

圖1 4種不同龍須菜之間生物量累積速率和線性生長速度比較Fig.1 Comparison of biomass accumulation and linear growth rate among 4strains of G.lemaneiformis

生物量累積速率結(jié)果比較表明，不同來源的龍須菜顯示出較為明顯的差異。由圖1可知，栽培品系中，生物量累積速率最快的是9.50%/d的07-2，其次是8.99%/d的981，ZC則為8.80%/d，3者之間沒有顯著性差異；野生的最慢，僅為6.36%/d，并且顯著低于3個栽培品系。

從線性生長速度來看，不同來源的龍須菜差別較大。與生物量累積速率不同，栽培品系中，ZC的線性生長速度最快，達(dá)9.89mm/d，其次為8.48mm/d的981和6.52mm/d的07-2，統(tǒng)計分析3個栽培品系間具有顯著性差異；6.45mm/d的野生顯著低于3個栽培品系。

2.2 PE和Chl a含量比較

圖2 4種不同龍須菜之間藻紅蛋白和葉綠素a含量比較Fig.2 Comparison of phycoerythrin and chlorophyll acontents among 4strains of G.lemaneiformis

不同材料2種光合色素含量見圖2。以野生為參考標(biāo)準(zhǔn)，其PE與 Chla含量分別為3.53mg/g、1.94 mg/g，981的PE和Chla含量分別增加了7.4%和10.8%；07-2的色素含量相差幅度都較大，PE和Chla比野生高24.4%、49.0%；而ZC的PE含量比野生高9.3%，Chla則低2.6%。多重比較結(jié)果顯示，ZC的PE含量顯著低于07-2，與981無明顯不同，但顯著高于野生；ZC的Chla含量與野生沒有明顯不同，顯著低于栽培品系981、07-2。

2.3 總蛋白質(zhì)含量比較

由圖3可知，4種龍須菜的總蛋白質(zhì)含量呈現(xiàn)顯著性差異。其中，ZC的總蛋白質(zhì)含量最高，為7.21mg/g，顯著高于野生6.99mg/g及栽培品系6.80mg/g的981與6.36mg/g的07-2。

圖3 4種不同龍須菜之間總蛋白質(zhì)含量比較Fig.3 Comparison of total protein content among 4 strains of G.lemaneiformis

2.4 光合放氧和呼吸耗氧速率比較

由圖4可知，4種龍須菜的光合放氧速率從高到低依次為ZC（20 714.0nmol O2·g－1FW·h－1）＞981（20 382.5nmol O2·g－1FW·h－1）＞野生（15 832.5 nmol O2·g－1FW·h－1）＞07-2（13 122.7nmol O2·g－1FW·h－1）；呼吸耗氧速率最高的是ZC，為4 433.0 nmol O2·g－1FW·h－1，最低的是2 482.5nmol O2·g－1FW·h－1的野生，栽培品系981與07-2介于二者之間。多重比較結(jié)果顯示，4種龍須菜的光合放氧和呼吸耗氧速率并無明顯不同。

圖4 4種不同龍須菜之間光合放氧和呼吸耗氧速率比較Fig.4 Comparison of the rate of photosynthetic oxygen evolution and respiration oxygen consumption among 4strains of G.lemaneiformis

2.5 SCAR標(biāo)記的開發(fā)與驗證

2.5.1 RSAP擴增結(jié)果 24個個體、15對引物共擴增出669個位點。RSAP擴增結(jié)果的聚丙烯酰胺凝膠電泳情況見圖5。

圖5 龍須菜24個樣品RSAP擴增結(jié)果的聚丙烯酰胺凝膠電泳圖示Fig.5 RSAP amplification result of 24samples of G.lemaneiformis resolved by PAGE analysis

2.5.2 ZC特異條帶的回收、測序以及SCAR引物設(shè)計與驗證 將篩選得到的ZC特異條帶回收測序后，得到大小為726bp的片段。在序列兩端設(shè)計SCAR引物，引物信息見表1。SCAR2引物對981、07-2、ZC各2個樣品和30株湛山灣野生四分孢子體共計36個龍須菜樣品的基因組DNA擴增結(jié)果見圖6，擴增片段大小為680bp。結(jié)果表明，特異SCAR2引物對981與ZC基因組DNA都可以擴增出預(yù)期大小的特異條帶，而在07-2和湛山灣野生四分孢子體中均無擴增條帶。利用之前本實驗室針對981的特異條帶設(shè)計的SCAR1引物（引物序列見表1）對ZC基因組DNA進行了擴增，發(fā)現(xiàn)在ZC中無擴增條帶的出現(xiàn)。用SCAR1和SCAR2引物組合進行基因組DNA擴增，ZC品系具有不同于其它樣品的擴增結(jié)果。結(jié)合這兩對SCAR引物達(dá)到對龍須菜新品系ZC進行特異檢測的目的。

3 討論

龍須菜栽培品系981與07-2都是經(jīng)過誘變處理選育而來的，具有耐高溫、速生抗逆等優(yōu)良性狀［9，15］，自被選育出來一直都是生產(chǎn)上的苗種來源，為龍須菜產(chǎn)業(yè)的迅速發(fā)展提供了堅實的基礎(chǔ)。但是在生產(chǎn)實踐中，隨著時間的推移都逐漸出現(xiàn)了種質(zhì)退化的跡象。本實驗室通過采孢子育苗和優(yōu)勢株選育相結(jié)合的方法，將野生藻體釋放的孢子（果孢子和四分孢子）采集到網(wǎng)簾上，通過水平掛養(yǎng)的方式養(yǎng)成，篩選出耐高溫、速生和抗逆性強的新品系ZC，測定了其一系列數(shù)量性狀，并與其他不同來源的龍須菜進行了比較研究。

圖6 SCAR2引物對龍須菜新個體的驗證PCR電泳圖Fig.6 Agarose gel profile of G.lemaneiformis individuals amplified with the SCAR2primer

有研究表明，江蘺藻體生物量累積速率、PE含量等參數(shù)易受外界環(huán)境因素的影響，如培養(yǎng)的條件、所用的培養(yǎng)基、試驗所取樣品的部位等，甚至連藻體生長狀況都會影響到試驗的結(jié)果［27］。因此，本試驗在進行生物量累積速率、線性生長速度以及色素含量等數(shù)量性狀的測定與測量時，盡量保持了培養(yǎng)條件的一致以及取樣部位的一致（如都盡量取三級分支），以確保本研究結(jié)果的準(zhǔn)確可靠。

龍須菜優(yōu)良品種的其中一個衡量參數(shù)是線性生長速度［15］。孟琳等［15］和陳偉洲［11］分 別將其 作為龍 須菜栽培品系07-2的篩選指標(biāo)以及對栽培品系07-2、07-1與981進行比較的指標(biāo)。本研究結(jié)果顯示，ZC的線性生長速度顯著地高于栽培品系981、07-2及野生個體，顯示了其較好的產(chǎn)業(yè)開發(fā)價值。

PE位于藻膽體中，是紅藻中的主要輔助色素，起到將光能轉(zhuǎn)移到光合體系的反應(yīng)中心轉(zhuǎn)變?yōu)榛瘜W(xué)能的作用，是藻類光合作用能力的一個重要的衡量生理指標(biāo)［28－31］。另外在氮元素缺乏時PE還可以作為功能性儲存氮來合成其他的蛋白質(zhì)［32］。Chla是所有藻類中含量最豐富和最基本的光合色素［33］。許多環(huán)境因素如光波長、金屬離子與N、P濃度等都能夠影響植物光合色素的含量［28，34－35］。Xu等［36］研究了不同水深處（離海水表層的距離）龍須菜的光合色素含量，隨水深的增加色素含量增加，特定生長速率降低。Han等［37］認(rèn)為藻類把能量用在色素的合成上，而用在生長的能量減少，從而使生長受到抑制。有研究表明，龍須菜具有三級分枝，不同分枝色素含量不同，一級分枝色素含量高于二級分枝，三級分枝色素含量最低［38］。本研究結(jié)果表明，ZC的PE含量明顯低于07-2，與981無顯著性差異，但Chla含量顯著地低于2個栽培品系。作者在實驗中也發(fā)現(xiàn)ZC的分支程度顯著高于981、07-2，這也許是導(dǎo)致其測定色素含量低的原因，而多分枝性狀可較好地滿足產(chǎn)業(yè)需求。

研究表明，龍須菜蛋白質(zhì)含量高，且必需氨基酸所占比例較高、種類齊全、比例也較適宜，是營養(yǎng)價值較高的蛋白質(zhì)資源［39］。另外，蛋白質(zhì)的含量在一定程度上反映了其體內(nèi)色素含量和酶水平［40］。通過比較來源不同的4個四分孢子體龍須菜，ZC的總蛋白含量顯著地高于2個栽培品系和野生藻株，可作為一種提供更高蛋白質(zhì)來源的鮑魚餌料使用［41］。

光合和呼吸作用是植物在生長過程中物質(zhì)和能量的來源，反映了代謝水平的高低。本試驗通過測定光合放氧和呼吸耗氧速率來研究龍須菜的光合和呼吸作用。藻類只能利用自由CO2和HC，并且對溶解于水中的CO2有高親和力，對HC的親和力較低［42］，因此藻類的光合和呼吸速率易受水中無機碳含量［43－44］和pH［45］的影響。另有研究表明，江蘺屬紅藻的光合和呼吸速率還受到光強和光質(zhì)［46］、氮和氨濃度［47－48］的影響。本研究結(jié)果顯示ZC與目前的主要栽培品系981、07-2以及野生株在光合放氧和呼吸耗氧速率方面并無顯著性差異，表明ZC在光合和呼吸作用方面并未與其他龍須菜材料顯現(xiàn)出明顯不同。

SCAR標(biāo)記一般是由RAPD，AFLP等轉(zhuǎn)化而來，一般情況下，研究者均是在篩選得到某一樣品的特異條帶后再進行這一工作［49］。由隨機標(biāo)記轉(zhuǎn)化為SCAR標(biāo)記，其成功的概率總體而言不是很高［50－52］。本研究中，對RSAP指紋圖譜進行分析時篩選到了龍須菜新品系ZC區(qū)別于其他材料的特有條帶，但是在驗證時對ZC和981基因組DNA都擴增出了同樣大小的條帶。一方面是受電泳凝膠分辨率和引物結(jié)合位點特異性的影響；另一方面是因為在設(shè)計引物時，只設(shè)計了一對引物組合，不可避免的影響了SCAR標(biāo)記轉(zhuǎn)化的成功率［49］。這同時也說明了SCAR標(biāo)記開發(fā)時驗證試驗的必要性。將此標(biāo)記與之前本實驗室獲得的981的SCAR標(biāo)記結(jié)合使用，可以實現(xiàn)對新品系ZC特異、穩(wěn)定鑒定。

通過測定一系列的不同來源龍須菜材料的生長與生理生化參數(shù)，豐富了龍須菜數(shù)量性狀的數(shù)據(jù)，同時也可以看出新品系ZC相較現(xiàn)有的栽培品系具備一定的栽培優(yōu)勢。另外，利用分子手段獲得了能夠鑒定ZC的、可能與其優(yōu)良經(jīng)濟性狀相關(guān)的特異性條帶。通過對ZC進行的生理生化及分子的相關(guān)研究工作，為龍須菜新品系ZC的后續(xù)推廣與應(yīng)用工作奠定一定的基礎(chǔ)。

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