李長雷

（江漢大學(xué)醫(yī)學(xué)院，湖北 武漢430056）

馬寶苗

（江漢大學(xué)武漢生物醫(yī)學(xué)研究院，湖北 武漢430056）

陳曉青，楊友華，易卉玲，黃麗霞，黃丹

（江漢大學(xué)醫(yī)學(xué)院，湖北武漢430056）

鐘守昌

（江漢大學(xué)教務(wù)處，湖北 武漢430056）

骨折愈合是一個(gè)非常復(fù)雜的骨再生過程，涉及到多種細(xì)胞及細(xì)胞間質(zhì)，大量蛋白質(zhì)、成千上百種基因的表達(dá)。他們相互協(xié)調(diào)、共同作用，導(dǎo)致了骨結(jié)構(gòu)的完整性和骨強(qiáng)度的恢復(fù)［1］。

研究骨折愈合的機(jī)制和促進(jìn)骨折愈合的方法，建立理想的動(dòng)物骨折模型是非常必要的。模型制備是否科學(xué)合理直接關(guān)系到實(shí)驗(yàn)結(jié)果的科學(xué)性、可靠性及可重復(fù)性［2－3］。經(jīng)過前人長期的探索與總結(jié)，目前在科研中作為建模對(duì)象的動(dòng)物有很多，如犬［4］、牛［5］、鼠［6－7］、豬［8］及兔等，實(shí)驗(yàn)兔橈骨骨折模型就是其中一類［9－11］。制作兔橈骨骨折模型的方法有很多種，與傳統(tǒng)方法中使用鈍器直接猛烈敲擊預(yù)造模部位以達(dá)到骨折的目的相比較，利用骨科電鋸制作的兔橈骨骨折模型成功率高，機(jī)體所受創(chuàng)傷小。在此基礎(chǔ)上，為了檢測(cè)低頻電磁場(chǎng)和低強(qiáng)度超聲波治療在單獨(dú)和聯(lián)合作用情況下對(duì)骨折損傷修復(fù)效果和對(duì)修復(fù)療效建立評(píng)價(jià)體系，研究人員利用骨科電鋸，選取兔建立一個(gè)理想的橈骨骨折模型。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

普通級(jí)成年健康日本大耳白兔30只（實(shí)驗(yàn)動(dòng)物質(zhì)量合格證編號(hào)：NO.42010000000194），平均體質(zhì)量2～2.5kg，雌雄各半，常規(guī)單籠飼養(yǎng)，自由進(jìn)食和飲水，飼料為全價(jià)顆粒料。實(shí)驗(yàn)過程在江漢大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心完成 ［實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證編號(hào)：SYXK（鄂）2007－0042］。

對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的處理方法均嚴(yán)格遵守國家科技部頒發(fā)的 《關(guān)于善待實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的指導(dǎo)性意見》之規(guī)定［12］。

1.2 試劑與儀器

PX－100CLK型移動(dòng)式醫(yī)用診斷X射線機(jī)（東芝／上海醫(yī)療器械廠有限公司）；小型骨科電鋸（江漢大學(xué)附屬醫(yī)院提供）；戊巴比妥鈉：含量≥99.0%，25g／瓶，批號(hào)：WS20120112，即配即用，江漢大學(xué)醫(yī)學(xué)院藥理教研室提供。

1.3 模型制作

兔適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，隨機(jī)分為7d、14d和21d三組，每組10只。造模過程：兔經(jīng)耳緣靜脈注射濃度為2.5% 的戊巴比妥鈉（1ml／kg），麻醉后，放置經(jīng)消毒后的外科手術(shù)臺(tái)，在雙前肢內(nèi)側(cè)橈骨中段處剪毛、消毒、備皮，再經(jīng)活力碘消毒，無菌條件下，通過手術(shù)方式切開皮膚，剝離周圍軟組織和血管，露出橈骨。用直徑為2cm、厚度為0.2cm的小型骨科電鋸沿橈骨垂直方向造成中段不完全橫斷骨折，骨折處寬度為0.2cm，深度為橈骨的2／3，止血、清創(chuàng)、縫合皮膚，不予固定（圖1a～d）。兔術(shù)后分籠飼養(yǎng)，每只動(dòng)物每日1次經(jīng)耳緣靜脈注射青霉素40萬U預(yù)防感染，共持續(xù)3d。

圖1 橈骨骨折模型制作過程

1.4 觀察指標(biāo)

造模總時(shí)長為21d。在造模后分別對(duì)7d、14d和21d組兔造模部位橈骨進(jìn)行X光照射取片，之后取材造模部位橈骨進(jìn)行組織病理學(xué)檢查，在動(dòng)態(tài)的情況下觀察不同時(shí)段骨折自行修復(fù)的情況。

1.4.1 X光照射取片 用PX－100CLK型移動(dòng)式醫(yī)用診斷X射線機(jī)進(jìn)行X光攝片，采用的電壓為55KV，電流量為125mA，焦距為81cm，曝光時(shí)間為1.1ms。在麻醉狀態(tài)下進(jìn)行X光拍片，每一個(gè)前肢拍攝一張X光片，觀察兔骨折后的自行修復(fù)狀況。

1.4.2 組織病理學(xué)檢測(cè) 在對(duì)全部兔骨折部位進(jìn)行X光照射取片后，處死家兔，立即以雙前肢橈骨骨折處為中心，取材長度為2cm的一段為標(biāo)本，經(jīng)10%甲醛溶液固定，再置于5%EDTA液中脫鈣，徹底沖洗，酒精梯度脫水，二甲苯透明，石蠟包埋，平行于橈骨縱軸經(jīng)橈骨中央過骨髓腔及兩側(cè)皮質(zhì)切取厚約5mm的長軸切片3張作蘇木精－伊紅染色（HE染色），做組織病理學(xué)檢測(cè)，分析骨折造模效果［13］。

2 結(jié)果

2.1 X光照射結(jié)果

造模后觀察7d組，2只為骨折處完全斷裂，移位明顯，有小塊骨碎片（圖2a）。8只兔前肢橈骨中段顯示為不完全橫斷骨折，且骨折斷端橫截面較整齊，邊緣較清晰（圖2b）。無明顯骨膜反應(yīng)；觀察14d組，大多數(shù)兔骨折斷端邊緣逐漸模糊不清，并伴有輕度骨膜反應(yīng)，有少量骨痂（圖2c）；觀察第21d組，兔骨折斷端邊緣已基本接近消失，但仍可疑似觀察到，伴有較深骨膜反應(yīng)，骨痂量增多，但未填滿缺損部位（圖2d）。

圖2 術(shù)后第7天、14天、21天動(dòng)物骨折處X射線片

2.2 組織病理學(xué)檢測(cè)

造模后觀察7d組，骨折斷端部位淤血腫塊較大，形成少量肉芽腫；觀察14d組，骨折斷端部位淤血腫塊基本被吸收，有較多纖維及成纖維細(xì)胞連接，小血管增生尚不明顯。形成較多的肉芽腫；觀察21d組，纖維結(jié)締組織增生，軟骨細(xì)胞生成，小血管增生較多。

3 討論

在制作兔橈骨骨折模型的眾多方法中，傳統(tǒng)方法固然可以建立骨折模型，但是造模的效果較差：會(huì)出現(xiàn)骨折部位不準(zhǔn)確、骨折范圍過大、骨碎片過多、傷及其他部位等現(xiàn)象；可能引發(fā)其他并發(fā)癥，對(duì)機(jī)體本身造成較大的傷害，不利于骨折的治療與分析。而利用骨科電鋸制作的兔橈骨骨折模型成功率高，定位準(zhǔn)確，傷口范圍小，出血量少，易于縫合、消毒、觀察和治療，避免感染帶來的并發(fā)癥，機(jī)體易于恢復(fù)健康，有助于骨折治療方法的探索與研究。

本次實(shí)驗(yàn)共使用兔30只，從拍攝的橈骨X光片和組織病理學(xué)結(jié)果分析，全部造模動(dòng)物均發(fā)生了骨折現(xiàn)象，其中2只因不符合造模要求外，其余兔橈骨骨折模型均取得成功。說明利用骨科電鋸制作兔橈骨骨折模型的方法具有很高的成功率。在造模后3周內(nèi)，動(dòng)態(tài)的觀察兔在骨折后的不同時(shí)段，均發(fā)生了自行修復(fù)現(xiàn)象。但這類現(xiàn)象發(fā)生的時(shí)間有先后，這屬于動(dòng)物個(gè)體差異性的表現(xiàn)。

與其它動(dòng)物相比，用兔建立骨折模型有以下優(yōu)點(diǎn)更適于造模：①兔的四肢屬于長骨，長骨通常是指上肢橈骨或者下肢脛骨，其骨質(zhì)結(jié)構(gòu)與人類相似度較高［14］。相比較與脛骨，橈骨只有皮膚和少量筋膜覆蓋，少血管，橈骨頭周緣有環(huán)狀關(guān)節(jié)面，下方光滑；下端特別膨大，近似立方形；更容易分離和暴露；且對(duì)機(jī)體造成的損傷較小，減少對(duì)骨折愈合的影響。②兔的骨骼轉(zhuǎn)化速度快，約達(dá)到了人類的3倍，可以在短期內(nèi)觀察骨折愈合時(shí)骨組織的變化［15］。③兔應(yīng)用廣泛，可以用合理的時(shí)間、工作和成本得到更有價(jià)值的數(shù)據(jù)；造模操作簡(jiǎn)便，成功率高，可以減少實(shí)驗(yàn)時(shí)間，降低外來影響因素對(duì)動(dòng)物模型的影響［2］。因此選擇兔的上肢橈骨制作骨折模型，研究低頻電磁場(chǎng)和低強(qiáng)度超聲波治療在單獨(dú)和聯(lián)合作用情況下對(duì)人類骨傷研究與治療，骨折的再生與修復(fù)，是一種較為理想的方法。

動(dòng)物模型是否科學(xué)合理，是否適用于人類疾病的模擬治療，需要從多方面進(jìn)行評(píng)估。第一，動(dòng)物模型的建立是否符合臨床診斷與治療的實(shí)際要求。因?yàn)榻?dòng)物模型的目的是用于對(duì)人類疾病的認(rèn)識(shí)、探索與研究，只有最大程度的滿足于臨床的實(shí)際需要，才能使實(shí)驗(yàn)的結(jié)果具有最大程度的科學(xué)性和可信度。如果動(dòng)物模型與相關(guān)的人類疾病出現(xiàn)較大的差異，那么模型就失去了意義。兔橈骨骨折模型雖然可以很好的模擬人類橈骨骨折時(shí)的病理狀態(tài)，但畢竟動(dòng)物不同于人類，兩者在解剖學(xué)和生物學(xué)等方面有一定程度的差異，而且骨折的修復(fù)與再生是一個(gè)涉及全局性的過程，所以即使在動(dòng)物模型上取得較好的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，也需要在臨床上進(jìn)行驗(yàn)證和評(píng)估［15－18］；第二，建立動(dòng)物模型的方法必須具有穩(wěn)定性和可重復(fù)性。開展動(dòng)物實(shí)驗(yàn)需要嚴(yán)格遵守重復(fù)的原則，才能使實(shí)驗(yàn)結(jié)果真實(shí)有效。因此需要的動(dòng)物模型都必須具有相同的穩(wěn)定的疾病模擬狀態(tài)；第三，建立動(dòng)物模型的方法要有較強(qiáng)的易操作性。實(shí)驗(yàn)過程中需要大量的樣本，動(dòng)物模型需要重復(fù)建造，如果造模難度過大，則會(huì)造成較大的工作量，也延長了每批次實(shí)驗(yàn)間隔的時(shí)間，增加了諸多不穩(wěn)定因素，可控性降低。

骨折動(dòng)物模型在研究人類骨折中起到非常重要的作用，采用合適的動(dòng)物模型可以對(duì)疾病研究起到事半功倍的效果［19］。一方面，出現(xiàn)骨折有較大的隨機(jī)性，而在臨床診斷和治療過程中還會(huì)不斷面臨新的問題，因此需要對(duì)臨床實(shí)踐問題進(jìn)行歸納和總結(jié)，以期建立符合實(shí)踐要求的動(dòng)物模型；另一方面，對(duì)已經(jīng)建立的動(dòng)物模型，既可以在此基礎(chǔ)上進(jìn)行多方位深層次的研究，也可以根據(jù)新情況不斷完善與改良。

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