耿艷輝，劉素彥，賀廣鋒

(微生物藥物國家工程研究中心/華北制藥集團(tuán)新藥研究開發(fā)有限責(zé)任公司，河北石家莊050015)

替考拉寧(teicoplanin)是繼萬古霉素、去甲萬古霉素之后的又一新型抗耐藥菌糖肽類抗生素，是由10個(gè)或11個(gè)碳脂肪鏈組成的復(fù)雜化合物，由 5個(gè)結(jié)構(gòu)相似的 TA2－1、TA2－2、TA2－3、TA2－4、TA2－5組成，分子量分別為1878，1880，1880，1 894，1 894，其中 TA2－2為主要成分，占各組分相對(duì)含量的40%以上［1－4］。由于替考拉寧化學(xué)結(jié)構(gòu)復(fù)雜，組分較多，因此需要建立快速、準(zhǔn)確、精密的分析方法，適用于替考拉寧生產(chǎn)過程中選種、發(fā)酵、提煉、精制的中間過程檢測(cè)。目前《中國藥典》(2010 版)［5］、《日本藥典》(JP16)［6］、《歐洲藥典》(EP7.0)［7］均登載了替考拉寧各組分含量測(cè)定方法，TA2－2出峰時(shí)間一般在18～24 min，整個(gè)色譜采集時(shí)間為40～45 min，分析時(shí)間較長，不適合生產(chǎn)過程的中間質(zhì)量控制分析。本文建立了梯度反相高效液相色譜分析法，用于檢測(cè)替考拉寧生產(chǎn)過程中的中控樣品，同時(shí)與《中國藥典》(2010版)方法測(cè)定結(jié)果作了比較，現(xiàn)將結(jié)果報(bào)道如下。

1 儀器與試藥

Agilent Technologies 1260 Infinity高效液相色譜儀;Agilent 1260 VWD紫外檢測(cè)器;Agilent ChemStation色譜工作站;Mettler toledo XS205電子天平。替考拉寧標(biāo)準(zhǔn)品，批號(hào):130374－201002，含量為89.4%，中國食品藥品檢定研究院;乙腈、三乙胺為色譜純，無水磷酸二氫鈉、氫氧化鈉為分析純，水為純化水。

2 方法與結(jié)果

2.1 溶液配制 ①標(biāo)準(zhǔn)品溶液:精密稱取替考拉寧標(biāo)準(zhǔn)品28 mg，用水溶解定容至50 mL容量瓶中，得溶液濃度為0.5 g/L。②發(fā)酵供試品溶液:精密稱取一定量的發(fā)酵液，用1 mol/L氫氧化鈉調(diào)節(jié)發(fā)酵液pH值到10±0.1，攪拌15 min后，離心取上清液，用1 mol/L鹽酸調(diào)pH值到6.5±0.1，再取一定量上述溶液用水稀釋至溶液濃度為0.5 g/L。③提煉供試品溶液:取一定量的解析液用水稀釋至溶液濃度為0.5 g/L。④粗粉供試品溶液:取一定量的粗粉用水溶解定容至50 mL容量瓶中，得溶液濃度為0.5 g/L。按色譜條件對(duì)標(biāo)準(zhǔn)品溶液、發(fā)酵供試品溶液、提煉供試品溶液、粗粉供試品溶液各進(jìn)樣20 μL進(jìn)行測(cè)定，按外標(biāo)法以5個(gè)組分峰高之和計(jì)算替考拉寧含量。

2.2 色譜條件 色譜柱:Waters Symmetry C18色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm);流速為 1.0 mL/min;柱溫為 40 ℃;檢測(cè)波長為254 nm;進(jìn)樣量為20 μL;流動(dòng)相為3.0 g/L無水磷酸二氫鈉緩沖液－乙腈，梯度洗脫程序見表1。流動(dòng)相配制:緩沖液，稱取3.0 g無水磷酸二氫鈉溶解于1 000 mL水中，加1 mL三乙胺，混勻后用1 mol/L氫氧化鈉溶液調(diào)pH值至6.5±0.1。A相:量取緩沖液900 mL，再加入100 mL乙腈，混勻。B相:量取950 mL乙腈，再加入50 mL水，混勻。在上述條件下，分別取標(biāo)準(zhǔn)品溶液、發(fā)酵供試品溶液、粗粉供試品溶液各20 μL進(jìn)樣測(cè)定，色圖譜見圖1～3。

表1 流動(dòng)相梯度洗脫程序

圖1 標(biāo)準(zhǔn)品色圖譜

圖2 發(fā)酵液色譜圖

圖3 粗粉色譜圖

2.3 線性試驗(yàn) 稱取替考拉寧標(biāo)準(zhǔn)品適量，用水溶解配制成系列替考拉寧標(biāo)準(zhǔn)品溶液，按試驗(yàn)方法對(duì)標(biāo)準(zhǔn)溶液系列進(jìn)行測(cè)定，替考拉寧質(zhì)量濃度在0.1～1.0 g/L濃度范圍內(nèi)與峰高呈線性，以質(zhì)量濃度X(g/L)為橫坐標(biāo)，峰高Y(mV)為縱坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸得線性方程為Y=499.52X+4.39，相關(guān)系數(shù)為 0.999 9。

2.4 回收率試驗(yàn) 取已知濃度的替考拉寧粗粉供試品溶液(0.503 7 g/L)6 mL 9 份，分別加入1，2，3 mL 替考拉寧標(biāo)準(zhǔn)品溶液(1.004 3 g/L)各3份，再用水定容至10 mL容量瓶中，按試驗(yàn)方法進(jìn)行測(cè)定，回收率結(jié)果見表2。

表2 替考拉寧加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果(n=9)

2.5 溶液穩(wěn)定性試驗(yàn) 標(biāo)準(zhǔn)品溶液、發(fā)酵供試品溶液、提煉供試品溶液、粗粉供試品溶液配制后于室溫下放置，分別在0，2，4，6，8 h按色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，替考拉寧5個(gè)組分峰高之和的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為 0.35%，0.68%，0.63%，0.57%，結(jié)果表明各測(cè)試溶液8 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.6 精密度試驗(yàn)

2.6.1 重復(fù)性 分別取發(fā)酵供試品溶液、提煉供試品溶液、粗粉供試品溶液，按色譜條件各平行測(cè)定6次，替考拉寧5個(gè)組分峰高之和的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為0.52%、0.44%、0.49%，方法具有良好的重復(fù)性。

2.6.2 中間精密度 由不同分析人員交替使用兩臺(tái)Agilent Technologies 1260 Infinity高效液相色譜儀按試驗(yàn)方法測(cè)定同一批次粗粉，每次平行測(cè)定雙份，共測(cè)定3次。按外標(biāo)法計(jì)算替考拉寧粗粉含量分別為 85.63%，85.01%，86.31%，86.84%，86.96%，85.59%，RSD 為 0.90%(n=6)。

2.7 樣品測(cè)定 取替考拉寧發(fā)酵液、提煉液、粗粉，按“2.1”項(xiàng)下方法制備各供試品溶液，分別用本方法和中國藥典2010版方法進(jìn)樣測(cè)定，按外標(biāo)法以替考拉寧五個(gè)組分峰高之和計(jì)算含量，結(jié)果兩方法檢測(cè)結(jié)果的相對(duì)平均偏差均在2.0%以內(nèi)，本方法檢測(cè)結(jié)果可靠，見表3。

表3 供試品檢測(cè)結(jié)果比較

3 討 論

選用國內(nèi)外不同品牌的十八烷基鍵合硅膠色譜柱5支進(jìn)行試驗(yàn)，色譜柱分別為 Welchrom C18，GALAK EF－C18(H)，Waters Symmetry C18，InertSustain C18和 Kromasil 10 － 5C18，結(jié)果表明Waters Symmetry C18色譜柱分離效果相對(duì)較好，TA2－2與TA2－3間的分離度均大于1.3，TA2－4與TA2－5間的分離度均大于1.2，且以TA2－2計(jì)算理論塔板數(shù)均大于10 000。

替考拉寧5個(gè)結(jié)構(gòu)相近的化合物中均含有1個(gè)羧基和1個(gè)氨基，系兩性化合物，等電點(diǎn)為5.1［8］，為了增加替考拉寧在流動(dòng)相中的溶解性，試驗(yàn)分別調(diào)節(jié)緩沖液pH值為5.5，6.0，6.5，7.0，7.5，結(jié)果表明緩沖液 pH 值為 6.5 時(shí)，5 個(gè)組分峰形尖銳且分離效果最好，故流動(dòng)相配制及發(fā)酵液供試品配制時(shí)均調(diào) pH 值為6.5±0.1。

替考拉寧結(jié)構(gòu)中含有羥基和羧基，導(dǎo)致5個(gè)組分色譜峰拖尾較嚴(yán)重，為改善峰形，流動(dòng)相中加入0.1%三乙胺來抑制峰形拖尾，最終得到了峰形尖銳對(duì)稱的色譜峰。本檢驗(yàn)方法回收率高、精密度好、適用性強(qiáng)，可用于替考拉寧生產(chǎn)過程中的中控樣品及粗粉的含量檢測(cè)。

［1］鄧晶晶，衛(wèi)薇.糖肽類抗生素替考拉寧的分析方法研究進(jìn)展［J］.西南軍醫(yī)，2009，11(5):925－926

［2］祝仕清，牛長群.替考拉寧中主要組分的LC－MS法測(cè)定［J］.分析測(cè)試學(xué)報(bào)，2008，27(11):23 －25

［3］張波.發(fā)酵液中替考拉寧含量的HPLC法測(cè)定［J］.中國實(shí)用醫(yī)藥，2011，23(6):38 －39

［4］薛晶，常艷，鄒文博，等.注射用替考拉寧的組分分析［J］.中國抗生素雜志，2010，35(11):848 －852

［5］國家藥典委員會(huì).中華人民共和國藥典:二部［S］.北京:中國醫(yī)藥科技出版社，2010:916－917

［6］The Ministry of Health，Labour and Welfare.Japanese Pharmacopoeia Sixteenth Edition［S］.Tokyo:The Ministry of Health，Labour and Welfare，2011:1466 －1469

［7］European Pharmacopoeia Commission.European Pharmacopoeia-7th Edition［S］.Strasbourg:European Directorate for Quality Medicines，2010:3038 －3040

［8］楊紅，秦川萍.HPLC法測(cè)定替考拉寧組分和有關(guān)物質(zhì)［J］.中國抗生素雜志，2006，31(3):184 －186