馮偉偉 阮為勇 步偉全

（江蘇省中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院，江蘇 南京 210028）

新生兒學(xué)在近年取得了很大進(jìn)步，但仍有許多相關(guān)疾病的發(fā)病機(jī)制尚未完全清楚。新生兒壞死性小腸結(jié)腸炎（NEC）就是其中之一。大量的臨床及實(shí)驗(yàn)研究證實(shí)應(yīng)用大黃及母乳喂養(yǎng)防治NEC有良好的前景。Lucas A等［1］通過臨床研究證實(shí)，單純母乳喂養(yǎng)新生兒的NEC的發(fā)病率較人工喂養(yǎng)新生兒明顯偏低。相關(guān)中醫(yī)的臨床及實(shí)驗(yàn)也證實(shí)，生大黃在防治NEC方面顯示了較好的臨床效果，且應(yīng)用前景廣泛［2-3］。近年來的研究認(rèn)為：NEC的發(fā)病機(jī)制可能與Toll樣受體（TLR）、脂多糖 （LPS）及NF-κB信號(hào)傳導(dǎo)的異常激活有密切關(guān)聯(lián)。TLR4是目前研究較多的Toll樣受體之一，TLR4的相關(guān)作用機(jī)制為：識(shí)別脂多糖（LPS）并介導(dǎo)其跨膜信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，進(jìn)而激活炎癥因子，受LPS活化后的TLR4進(jìn)一步啟動(dòng)相關(guān)腸道黏膜細(xì)胞的炎癥反應(yīng)，該機(jī)制已被證實(shí)與包括NEC在內(nèi)的許多感染性疾病密切相關(guān)［4-8］。母乳防治NEC有顯著的療效，母乳中含有免疫球蛋白、乳鐵蛋白、淋巴細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、溶菌酶等多種免疫調(diào)節(jié)因子，以及表皮生長(zhǎng)因子、雙歧因子、核酸等多種生物活性物質(zhì)，上述因子能夠顯著改善胃腸道的免疫防御功能，使其免受致病菌侵犯并減輕炎癥損傷；大黃可“蕩滌胃腸、推陳致新、調(diào)中化食，安和五臟”［9］，其主要作用部位在腸道，能夠促進(jìn)胃腸道蠕動(dòng)、保護(hù)黏膜屏障，同時(shí)有清除腸道內(nèi)細(xì)菌和內(nèi)毒素、預(yù)防腸道細(xì)菌易位、改善微循環(huán)、促進(jìn)胃腸道新陳代謝、調(diào)節(jié)免疫等功效。目前尚未見有關(guān)大黃及母乳對(duì)NEC腸道炎癥細(xì)胞Toll樣受體表達(dá)影響的報(bào)道。本課題擬探討在大黃上清液及母乳的干預(yù)下Caco-2炎癥細(xì)胞Toll樣受體表達(dá)的變化，進(jìn)一步揭示防治NEC的具體作用機(jī)制，現(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 母乳及大黃有效成分的提取 （1）母乳上清液的提?。耗溉閬碜杂诮K省中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院婦產(chǎn)科產(chǎn)婦6例，每位產(chǎn)婦均產(chǎn)出1名足月兒且無(wú)妊娠期并發(fā)癥。生后2～4 d的母乳存于4℃冰箱，在24 h內(nèi)處理，12000 r/min離心10min去除脂肪成分和細(xì)胞碎片，保留乳清用于實(shí)驗(yàn)，然后存于-20℃冰箱備用。（2）大黃上清液的提取：江蘇省中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院中藥房提供生大黃粉1 g加入磷酸鹽緩沖液 （PBS）5 mL攪拌混勻，靜置10min后取其上清液為淡黃色母液，分別配制為0.1%、1%、2.5%3個(gè)不同的大黃濃度。

1.2 細(xì)胞與試劑 Caco-2細(xì)胞株（購(gòu)自中科院上海細(xì)胞 庫(kù) ）；Dual-luciferase reporter assay system （promega usa）；人外周血紅細(xì)胞裂解液（中國(guó)深圳晶美生物工程有限公司）；無(wú)水丙酮（中國(guó)長(zhǎng)沙麗欣生物工程有限公司）；多聚賴氨酸（中國(guó)長(zhǎng)沙麗欣生物工程有限公司）；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒 （美國(guó)MBI Fermentas公司）；PCR試劑盒（美國(guó)MBI Fermentas公司）；Tr1201試劑（美國(guó)Ivitrogen公司）；DNA Marker DL 2000（中國(guó)大連寶生物技術(shù)有限公司）；瓊脂糖（BBI公司，由中國(guó)上海生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司分裝）；Tris堿、0.5×TBE電極緩沖液、硼酸等試劑為國(guó)家分析純產(chǎn)品（中國(guó)上海生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司）；PCR引物（中國(guó)上海生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司）：GAPDH 引物 F：5′-ACCACA GTCCATGCCATCAC-3′；GAPDH 引物 R：5′-TCCACCACCCTGTTGCTGTA-3′。

1.3 主要儀器 5415R高速臺(tái)式離心機(jī)（Germany，Eppendorf）；7500 熒光定量 PCR 儀（USA，ABI）；CentroX3超靈敏微孔板發(fā)光檢測(cè)儀（Germany，BERTHOLD）；Mini Trans-Blot轉(zhuǎn)移電泳槽、Mini ProteanⅢ蛋白垂直電泳槽、PowerPac 200/HC/3000電泳儀、Mini-Sub Cell GT 水平電泳槽 （USA，BIO-RAD）；EDC-810 PCR儀（中國(guó)，東勝）；311/3141細(xì)胞培養(yǎng)箱（USA，ThermoFisher），d-63450 生物安全柜（Germany，Heal Force）；凝膠成像儀（England，Syngene）；ND-1000核酸蛋白測(cè)定儀 （USA，Nano Drop）；ELx 808酶標(biāo)儀（USA，BIO-TEK）。

1.4 Caco-2細(xì)胞培養(yǎng) Caco-2細(xì)胞適宜在37℃、5%CO2和90%相對(duì)濕度的環(huán)境中培養(yǎng)，采用DMEM培養(yǎng)基，包含10%胎牛血清、1%非必需氨基酸、1%谷氨酰胺和青霉素-鏈霉素雙抗液。細(xì)胞培養(yǎng)在75 cm2培養(yǎng)瓶中，每5日按1∶3的比例傳代，傳代后6～7 d細(xì)胞生長(zhǎng)達(dá)到融合。

1.5 炎癥細(xì)胞模型分組 （1）對(duì)照組：檢測(cè)正常Caco-2細(xì)胞中Toll樣受體mRNA表達(dá)。（2）TNF-α誘導(dǎo)組：向TNF-α誘導(dǎo)的Caco-2炎癥細(xì)胞中同時(shí)加入常規(guī)培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)24 h，檢測(cè)Caco-2細(xì)胞中Toll樣受體mRNA 表達(dá)量。（3）TNF-α+1%大黃組：向 TNF-α 誘導(dǎo)的Caco-2細(xì)胞中加入1%大黃上清液，繼續(xù)培養(yǎng)24 h，檢測(cè)Caco-2細(xì)胞中Toll樣受體mRNA表達(dá)量。（4）TNF-α+1%母乳組：向TNF-α誘導(dǎo)的Caco-2細(xì)胞中加入1%母乳上清液，繼續(xù)培養(yǎng)24 h，檢測(cè)Caco-2細(xì)胞中Toll樣受體mRNA表達(dá)量。（5）TNF-α+1%大黃+1%母乳組：向TNF-α誘導(dǎo)的Caco-2細(xì)胞中同時(shí)加入1%大黃上清液和1%母乳上清液，繼續(xù)培養(yǎng)24 h，檢測(cè)Caco-2細(xì)胞中Toll樣受體mRNA表達(dá)量。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS18.0統(tǒng)計(jì)軟件處理。計(jì)量資料以（）表示，組間比較采用單因素方差分析。P＜0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，以P＜0.01為有顯著意義。

2 結(jié) 果

各組實(shí)驗(yàn)細(xì)胞中Toll樣受體mRNA的相對(duì)表達(dá)量見表1。由實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，1%的大黃上清液、1%母乳及兩者聯(lián)合聯(lián)合均可降低Caco-2炎癥細(xì)胞TLR4 mRNA的表達(dá)，與TNF-α誘導(dǎo)組比較均有顯著差異（P＜0.01）；1%大黃聯(lián)合1%母乳干預(yù)較1%大黃干預(yù)作用明顯，有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.01）；1%大黃聯(lián)合1%母乳干預(yù)較單用1%母乳干預(yù)作用明顯（P＜0.05）；1%母乳干預(yù)較1%大黃干預(yù)作用明顯，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

表1 各組TLR4 mRNA的表達(dá)（）

表1 各組TLR4 mRNA的表達(dá)（）

與TNF-α誘導(dǎo)組比較，*P＜0.01；與TNF-α+1%大黃+1%母乳組比較，△P＜0.05，△△P＜0.01。

3 討 論

NEC是新生兒尤其是早產(chǎn)兒常見的消化道危急重癥，新生兒重癥監(jiān)護(hù)病房中NEC的發(fā)生率為1%～5%，而在極低出生體重兒中發(fā)生率高達(dá)5%～10%。NEC的死亡率可高達(dá)32%，近年來隨著小兒外科和重癥醫(yī)學(xué)的進(jìn)步，NEC病死率已下降到20%左右，NEC在NICU中的高發(fā)生率和死亡率對(duì)早產(chǎn)兒預(yù)后產(chǎn)生重要的影響［10］。治療方面，近年來，有報(bào)道應(yīng)用大黃及母乳防止NEC取得了良好的臨床療效。關(guān)于兩者防治NEC的具體作用機(jī)制罕見報(bào)道，本實(shí)驗(yàn)體外培養(yǎng)了與人腸上皮細(xì)胞生物學(xué)功能相似的人結(jié)腸腺癌細(xì)胞系，并用TNF-α刺激該細(xì)胞，以模擬腸道的炎癥反應(yīng)，探討炎癥狀態(tài)時(shí)腸上皮細(xì)胞的生物學(xué)功能。對(duì)于本病的發(fā)病機(jī)制，研究表明可能與TLR、NF-κB信號(hào)傳導(dǎo)的異常激活及LPS相關(guān)。

本課題主要研究指標(biāo)之一TLR4，主要識(shí)別LPS等炎癥介質(zhì)并介導(dǎo)其跨膜信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)激活炎癥因子，TLR4在受LPS活化后，將啟動(dòng)一系列腸道黏膜細(xì)胞的炎癥反應(yīng)，這已被證實(shí)與包括NEC在內(nèi)的多種感染性疾病密切相關(guān)［4］。Toll樣受體是一種免疫受體，具有跨膜信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)功能，能夠識(shí)別存在于病原體細(xì)胞表面的分子標(biāo)志，并與其結(jié)合產(chǎn)生信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，最終觸發(fā)炎癥反應(yīng)［5-6］。TLR4是Toll樣受體中研究較為深入的，其能識(shí)別相關(guān)細(xì)胞因子并結(jié)合成復(fù)合物，進(jìn)一步將此信號(hào)轉(zhuǎn)入細(xì)胞內(nèi)，最終激活核轉(zhuǎn)錄因子NF-κB，NF-κB作為促炎癥基因表達(dá)的樞紐之一［4］，在靜息狀態(tài)下κB抑制蛋白（IkB）和NF-κB結(jié)合在一起存在于胞質(zhì)中，當(dāng)細(xì)胞受到缺氧、感染及炎性細(xì)胞因子等刺激后，IκB激酶發(fā)生降解，繼而NF-κB進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)發(fā)揮其基因調(diào)控作用，NF-κB 活化后可增強(qiáng) TNF-κB、IL-6 等炎癥因子基因的信號(hào)表達(dá)，上調(diào)炎癥反應(yīng)使TNF-α、IL-6等炎癥因子產(chǎn)生釋放增多；然而TNF-α、IL-6等炎癥因子又可以進(jìn)一步激活NF-κB，導(dǎo)致最初的炎癥信號(hào)進(jìn)一步放大，造成過度的炎癥反應(yīng)。

本研究結(jié)果顯示，1%大黃上清液、1%母乳上清液、1%大黃上清液聯(lián)合1%母乳上清液對(duì)Caco-2炎癥細(xì)胞Toll樣受體mRNA的相對(duì)表達(dá)量均有明顯抑制作用，相對(duì)于加入常規(guī)培養(yǎng)液的TNF-α誘導(dǎo)組（均P＜0.01），差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。1%大黃上清液聯(lián)合1%母乳上清液組較1%大黃上清液組效果更明顯（P＜0.01），兩組差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；1%大黃上清液聯(lián)合1%母乳上清組較1%母乳上清液組作用強(qiáng)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；1%母乳上清液組較1%大黃上清液組作用強(qiáng)，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

本試驗(yàn)結(jié)果可以證明，經(jīng)TNF-α刺激后，Caco-2細(xì)胞中高表達(dá)TLR4。分別予以大黃上清液、母乳及兩者聯(lián)合干預(yù)炎癥細(xì)胞模型后，Toll樣受體mRNA的表達(dá)量有不同程度下降，說明Toll樣受體參與了NEC的發(fā)病過程，且說明1%大黃上清液、1%母乳上清液、1%大黃上清液聯(lián)合1%母乳上清液可降低Caco-2炎癥細(xì)胞Toll樣受體mRNA的過度表達(dá)，從而起到延緩NEC進(jìn)展的作用。

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