肖璜，林吉恒，馬仕洪，胡昌勤

藥品微生物檢驗(yàn)是評(píng)價(jià)藥品質(zhì)量的重要手段之一。《中國(guó)藥典》2005年版增加了對(duì)藥品進(jìn)行無菌檢查和微生物限度檢查時(shí)需進(jìn)行方法學(xué)驗(yàn)證和對(duì)培養(yǎng)基進(jìn)行靈敏度檢測(cè)的要求，通過檢測(cè)實(shí)驗(yàn)菌株在試驗(yàn)系統(tǒng)中生長(zhǎng)能力，判斷實(shí)驗(yàn)體系的適用性。在上述檢測(cè)過程中，標(biāo)準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)菌株的純度、生物學(xué)特性的變異都會(huì)影響檢驗(yàn)結(jié)果。因此，在藥品微生物實(shí)驗(yàn)室中，如何評(píng)估保藏菌株在使用過程中的死亡、衰退和變異，保持實(shí)驗(yàn)菌株的原有生物學(xué)特征等問題就變的尤為重要[1]。對(duì)藥品微生物實(shí)驗(yàn)室中標(biāo)準(zhǔn)菌種保藏的研究分為兩個(gè)方向[2]：一是為基層單位尋找簡(jiǎn)單、實(shí)用和經(jīng)濟(jì)的方法；二是為科研機(jī)構(gòu)尋找能確保長(zhǎng)期穩(wěn)定保藏的方法。

枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）是藥品微生物實(shí)驗(yàn)室最常用的標(biāo)準(zhǔn)菌株之一?？莶菅挎邨U菌處于孢子體時(shí)其代謝呈最不活躍或相對(duì)靜止的狀態(tài)，有利于長(zhǎng)期保存，如能利用枯草芽孢桿菌孢子體作為保藏菌種，將方便檢驗(yàn)過程?，F(xiàn)行的《中國(guó)藥典》（2010年版）對(duì)于菌液的要求：若在室溫下放置，應(yīng)在 2 h 內(nèi)使用；若保存在 2～8 ℃，可在 24 h 內(nèi)使用；黑曲霉孢子懸液可保存在 2～8 ℃，在驗(yàn)證過的貯存期內(nèi)使用?！睹绹?guó)藥典》36 版（USP36）中指出，枯草芽孢桿菌及黑曲霉的穩(wěn)定孢子懸液均可在驗(yàn)證過的貯存期內(nèi)保存并直接稀釋使用。由此可見，枯草芽孢桿菌孢子懸液作為枯草芽孢桿菌的保藏形式其穩(wěn)定性是得到肯定的。但在兩國(guó)藥典中，對(duì)于貯存期并未做過多描述。

本文以枯草芽孢桿菌孢子體為研究對(duì)象，基于使用的便利性和應(yīng)用過程中的可靠性，設(shè)計(jì)了計(jì)數(shù)實(shí)驗(yàn)及藥敏實(shí)驗(yàn)，考察枯草芽孢桿菌孢子體在蒸餾水保存法中保藏的貯存期，為檢驗(yàn)過程中的便利使用提供數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 儀器與試藥

Ⅱ 級(jí) A2 型生物安全柜為美國(guó) Thermo 公司產(chǎn)品；RD115 型恒溫培養(yǎng)箱為德國(guó) Binder 公司產(chǎn)品；BT2202S型電子天平為賽多利斯公司產(chǎn)品；MLS-3780 型滅菌器為SANYO 公司產(chǎn)品；營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基和胰蛋白胨大豆肉湯（TSB）購(gòu)自北京三藥公司；枯草芽孢桿菌[CMCC(B)63501]購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院，使用其二代菌株；鹽酸莫西沙星氯化鈉注射液（0.4 g/250 ml）購(gòu)自方正醫(yī)藥研究院有限公司。

1.2 方法

1.2.1 菌液制備 枯草芽孢桿菌接種至營(yíng)養(yǎng)瓊脂克氏瓶中，35 ℃ 培養(yǎng) 7 d；用含 0.05% 吐溫的滅菌蒸餾水吹洗振蕩，制成高濃度孢子菌懸液。用含 0.05% 吐溫的滅菌蒸餾水稀釋原始菌液，分裝于滅菌后的菌種凍存管（1 ml/管）中。將上述菌種凍存管分成兩組，一組放置在室溫（25 ℃）中保藏，另一組放置在冰箱（4 ℃）中保藏?？疾旖?jīng) 65 ℃ 加熱 30 min 滅活前后的原始菌液計(jì)數(shù)結(jié)果。

1.2.2 實(shí)驗(yàn)計(jì)數(shù) 采用營(yíng)養(yǎng)瓊脂進(jìn)行計(jì)數(shù)。分別于固定時(shí)間間隔（0 個(gè)月、1 個(gè)月、2 個(gè)月、3 個(gè)月）取不同保藏條件的 5 株菌進(jìn)行梯度稀釋，每株計(jì)數(shù)三皿，于 35 ℃ 培養(yǎng)24 h 后進(jìn)行計(jì)數(shù)。

1.2.3 藥敏試驗(yàn) 參考 CLSI/NCCLS 推薦的微量稀釋法，分別于固定時(shí)間間隔（0 個(gè)月、1 個(gè)月、2 個(gè)月、3 個(gè)月）進(jìn)行藥敏實(shí)驗(yàn)。取 96 孔微量反應(yīng)板，每孔分別加入180 μl 胰蛋白胨大豆肉湯；首樣品組加入鹽酸莫西沙星氯化鈉注射液 20 μl，混勻；隨后各樣品組取前一樣品組中的20 μl 混合液，混勻；共設(shè) 10 個(gè)樣品組。最后每孔加孢子懸液 20 μl。設(shè)不加試藥的細(xì)菌對(duì)照組和無細(xì)菌的空白對(duì)照組，在 25 ℃ 培養(yǎng) 2 d 后觀察其 MIC 濃度。每個(gè)保存條件重復(fù)試驗(yàn) 4 次。

2 結(jié)果

2.1 菌液制備

保存在含 0.05% 吐溫的滅菌蒸餾水中的枯草芽孢桿菌孢子懸液，經(jīng) 65 ℃ 加熱 30 min 滅活后原始菌液計(jì)數(shù)結(jié)果未見顯著性降低（表 1）?！吨袊?guó)藥典》（2010年版）抗生素微生物檢定法附錄下規(guī)定，用滅菌水洗下枯草芽孢桿菌的芽孢后，要在 65 ℃ 加熱 30 min，通過熱損傷殺死枯草芽孢桿菌的營(yíng)養(yǎng)體。由于表 1 中加熱前后的菌落計(jì)數(shù)未見顯著性降低，提示此步驟在對(duì)枯草芽孢桿菌孢子體的吐溫-蒸餾水保藏法中可能并非必需。

2.2 實(shí)驗(yàn)計(jì)數(shù)

藥品微生物實(shí)驗(yàn)室中，枯草芽孢桿菌的常用保存方法為斜面低溫保存法和菌懸液冷凍保存法。文獻(xiàn)[3]報(bào)道使用營(yíng)養(yǎng)瓊脂斜面低溫（4 ℃）保藏可達(dá) 5年時(shí)間，使用營(yíng)養(yǎng)肉湯超低溫（–20 ℃）保藏可達(dá) 4年時(shí)間。兩種方法操作簡(jiǎn)單，使用方便，不需特殊設(shè)備。但培養(yǎng)基在傳代過程中物理、化學(xué)特性的變化造成菌體代謝的改變，進(jìn)而易誘導(dǎo)菌株的變異[4]。已有枯草芽孢桿菌因傳代次數(shù)過多易變成光滑型菌株影響抗生素效價(jià)測(cè)定的文獻(xiàn)報(bào)道[3]。同時(shí)，屢次傳代污染雜菌的機(jī)會(huì)增多。另外，基層實(shí)驗(yàn)室中超低溫冰箱的配備并不普及。為克服上述不利因素，本研究中實(shí)驗(yàn)溫度僅考慮了25 ℃ 和 4 ℃。同時(shí)，計(jì)數(shù)以及藥敏實(shí)驗(yàn)環(huán)節(jié)均采用直接稀釋的方法，以避免多次傳代的影響。

表1 滅活前后原始菌液計(jì)數(shù)結(jié)果

保存在含 0.05% 吐溫的滅菌蒸餾水中的枯草芽孢桿菌孢子懸液，在不同保藏溫度（25 ℃ 和 4 ℃）條件下，菌數(shù)相對(duì)穩(wěn)定（圖 1）?？紤]到數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)的便利性，將以上結(jié)果經(jīng)求對(duì)數(shù)做方差分析，結(jié)果見表 2。經(jīng)方差分析，25 ℃（室溫）及 4 ℃（低溫）兩種保存條件下菌數(shù)在考察時(shí)間內(nèi)出現(xiàn)增長(zhǎng)的趨勢(shì)。同時(shí)，經(jīng)兩兩比較，兩種保存條件下，第 2、3 個(gè)月顯著高于第 0、1 個(gè)月的結(jié)果（P < 0.01），而第 0、1 個(gè)月之間和第 2、3 個(gè)月之間沒有顯著性差異，說明兩種保存條件下，1 個(gè)月內(nèi)菌落計(jì)數(shù)無顯著性差異。

2.3 藥敏試驗(yàn)

將兩種保存條件的枯草芽孢桿菌孢子懸液做藥敏實(shí)驗(yàn)，結(jié)果見表 3。25 ℃（室溫）及 4 ℃（低溫）兩種保存條件下的枯草芽孢桿菌孢子懸液在第一個(gè)月內(nèi)其藥敏結(jié)果不變，而在 2、3 個(gè)月內(nèi)結(jié)果發(fā)生變化。

3 討論

文獻(xiàn)報(bào)道枯草芽孢桿菌營(yíng)養(yǎng)體菌體脆弱，在室溫及低溫條件下第 2 天即大量死亡，在室溫與低溫中衰退較快[5]。當(dāng)枯草芽孢桿菌處于孢子體時(shí)其代謝呈最不活躍或相對(duì)靜止的狀態(tài)，有利于長(zhǎng)期保存。因此本次實(shí)驗(yàn)中，我們考察了相對(duì)靜止?fàn)顟B(tài)的孢子體的穩(wěn)定性，在 3 個(gè)月的保藏過程中，菌液不僅存活率未見衰退，在室溫與低溫兩種實(shí)驗(yàn)條件下都出現(xiàn)了增長(zhǎng)的趨勢(shì)，結(jié)果令人滿意。由于藥品微生物實(shí)驗(yàn)室工作菌株在應(yīng)用中主要采用梯度稀釋法，因此，原始菌液的濃度是十分重要的質(zhì)控環(huán)節(jié)。本次實(shí)驗(yàn)通過計(jì)數(shù)實(shí)驗(yàn)探索貯存期內(nèi)孢子懸液濃度的變化。結(jié)果顯示：25 ℃（室溫）及4 ℃（低溫）兩種保存條件下菌數(shù)在考察期內(nèi)出現(xiàn)趨勢(shì)性增長(zhǎng)。兩種保存條件下，1 個(gè)月內(nèi)菌落計(jì)數(shù)無顯著性差異。

菌種在貯存期內(nèi)是否存在退行性變異也是需要考慮的問題。基于藥品微生物檢驗(yàn)中通常利用枯草芽孢桿菌進(jìn)行適用性實(shí)驗(yàn)，通過檢測(cè)系統(tǒng)最終是否抑制試驗(yàn)菌株的生長(zhǎng)，判斷體系的實(shí)用性的目的，我們?cè)O(shè)計(jì)了藥敏試驗(yàn)，通過分析枯草芽孢桿菌對(duì)抑菌成分的敏感性，表征其生物學(xué)特性是否發(fā)生變異。CLSI/NCCLS 推薦的培養(yǎng)條件為 CAMHB（調(diào)節(jié)了鈣鎂離子濃度的 MH 肉湯）、35 ℃；而在《美國(guó)藥典》無菌檢查章節(jié)中，枯草芽孢桿菌可在 25 ℃ 使用胰蛋白胨大豆肉湯（TSB）培養(yǎng)觀察；基于使用目的，我們參照《美國(guó)藥典》確定了藥敏實(shí)驗(yàn)條件。實(shí)驗(yàn)表明，兩種保存條件1 個(gè)月貯存期內(nèi)，枯草芽孢桿菌孢子體的藥物敏感性未出現(xiàn)變化，但貯存期超過 1 個(gè)月后，藥物敏感性發(fā)生變化，不宜再作為方法驗(yàn)證的標(biāo)準(zhǔn)菌株使用。

圖1 不同儲(chǔ)存溫度的菌液計(jì)數(shù)結(jié)果

表2 方差分析結(jié)果

表3 藥敏實(shí)驗(yàn)結(jié)果（μg/ml）

枯草芽孢桿菌以孢子懸液的形式進(jìn)行保存，具有簡(jiǎn)單、使用方便等優(yōu)點(diǎn)。貯存期驗(yàn)證表明，在 25 ℃（室溫）及4 ℃（低溫）兩種保存條件下，枯草芽孢桿菌孢子懸液 1 個(gè)月內(nèi)計(jì)數(shù)與藥敏結(jié)果均穩(wěn)定，可直接稀釋使用。

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