蔡曉娜，王鵬，賀曉強(qiáng)，劉立平，陳海容，郭晉霞，范開

重組白細(xì)胞抑制因子-水蛭肽嵌合蛋白（recombinant neutrphil inhibitory factor and hirulog hybrid，TNHH）是一種通過基因工程技術(shù)改造的新型嵌合蛋白，臨床上可用于急性腦栓塞后的腦組織損傷修復(fù)，減少腦水腫，防止微小血栓形成從而改善微循環(huán)，是一種有前景的心腦血管疾病治療創(chuàng)新藥物，目前已進(jìn)入臨床 I、II 期研究[1-2]。由于在生產(chǎn)過程中使用了工程菌大腸桿菌，而宿主菌的殘留 DNA 是重組藥物中特有的潛在致癌性雜質(zhì)，可能會(huì)隨藥物一同進(jìn)入人體最終致癌，因此對(duì) TNHH 原液中外源性 DNA 殘留量的檢測(cè)極為重要[3]。

目前對(duì)重組生物制品的殘留宿主 DNA 檢測(cè)方法有多種[4-6]，與其他方法相比，地高辛標(biāo)記探針雜交法具有靈敏度高、特異性強(qiáng)、對(duì)操作人員無(wú)放射危害等優(yōu)點(diǎn)[7]。本文采用分子雜交法，從小片段基因組 DNA 的制備、純化、處理、陽(yáng)性樣品的制備等方面進(jìn)行優(yōu)化，建立了 TNHH 制備過程中工程菌 DNA 殘留的質(zhì)控方法。

1 材料與方法

1.1 材料

TNHH 工程菌、TNHH 原液由重慶富進(jìn)生物醫(yī)藥有限公司制備；地高辛標(biāo)記和檢測(cè)試劑盒購(gòu)自美國(guó)羅氏公司；正電荷尼龍膜購(gòu)自美國(guó)安瑪西亞公司；細(xì)菌基因組 DNA 提取試劑盒購(gòu)自美國(guó) Invitrogen 公司。

1.2 方法

1.2.1 工程菌基因組 DNA 的制備 按照基因組 DNA提取試劑盒說明制備 TNHH 工程菌基因組 DNA，并通過1% 瓊脂糖凝膠電泳和微量核酸蛋白測(cè)定儀測(cè)定 DNA 純度和濃度，并于 –20 ℃ 凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 模板 DNA 的制備 超聲處理基因組 DNA，恒定功率，不同超聲次數(shù)得到大小不同的 DNA 樣品，電泳檢測(cè) DNA 片段大小。

1.2.3 探針的制備 取 1 μg 超聲處理過的基因組 DNA，加入無(wú)菌水至終體積 16 μl，沸水浴 10 min 后，立即冰浴10 min 迅速冷卻。取 4 μl 地高辛高效標(biāo)記引物加入變性DNA 中，混勻后 500×g 離心 20 s。37 ℃ 孵育過夜，加入 2 μl 0.2 mol/L EDTA（pH 8.0）終止反應(yīng)，置于 –20 ℃ 保存。另一組 EDTA 終止后，加 5 μl 4 mol/L 氯化鋰、75 μl 冰乙醇，然后置于 –20 ℃，2 h。15000×g 離心 15 min 后，用 100 μl 70% 的乙醇洗一次，風(fēng)干后加 50 μl TE 緩沖液復(fù)溶上述沉淀即為純化的探針。

1.2.4 探針標(biāo)記效率的檢測(cè) 先將標(biāo)記好的兩組探針和地高辛標(biāo)記對(duì)照探針稀釋成 l ng/μl，再分別依次稀釋至 10、3、1、0.3、0.1、0.03、0.01 pg/μl，分別取 1 μl 各濃度樣品點(diǎn)于尼龍膜上，經(jīng)固定和封閉后，進(jìn)行 Anti-DIG-AP 和NBP/BCIP 顯色反應(yīng)。

1.2.5 供試液的制備

1.2.5.1 陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)品及供試品溶液、陽(yáng)性樣品的制備

⑴陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn) DNA 溶液的制備：用 pH 8.0 的 TE 溶液稀釋工程菌基因組 DNA 至 10 ng/μl，然后依次 10 倍稀釋為 1 ng/μl、0.1 ng/μl、10 pg/μl、1 pg/μl、0.1 pg/μl。陰性對(duì)照為 TE 溶液。

⑵供試品溶液的制備：取 3 批 TNHH 原液，用 TE 溶液將樣品稀釋至每 300 μl 含 4 mg TNHH （相當(dāng)于臨床最大劑量）用于點(diǎn)膜。

⑶陽(yáng)性樣品的制備：取供試品 450 μl，加 10 ng/μl 標(biāo)準(zhǔn) DNA 溶液 1.5 μl，使其中含 1.5 ng標(biāo)準(zhǔn) DNA，即與陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn) 1 ng 對(duì)比。

1.2.5.2 樣品處理

⑴制備的陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)、供試品溶液及陽(yáng)性樣品不進(jìn)行任何處理；

⑵分別按表 1 反應(yīng)體系進(jìn)行處理；

表1 樣品處理反應(yīng)體系

⑶按表 1 反應(yīng)體系進(jìn)行處理后，DNA 純化試劑盒進(jìn)行回收；

⑷按表 1 反應(yīng)體系進(jìn)行處理后，酚氯仿抽提法進(jìn)行回收。

1.2.6 點(diǎn)膜、固定、雜交和免疫檢測(cè) 將 1.2.5 項(xiàng)下不同處理方法所得陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)品系列、供試品、陽(yáng)性樣品、陰性對(duì)照品和空白對(duì)照品（未經(jīng)過蛋白酶 K 預(yù)處理的 TE 緩沖液）按地高辛標(biāo)記檢測(cè)試劑盒說明書進(jìn)行變性、點(diǎn)膜、固定、雜交、洗膜和免疫檢測(cè)。顯色后，將供試品與陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)比較，根據(jù)顯色深淺判定原液中宿主 DNA 的含量。

2 結(jié)果

2.1 工程菌基因組 DNA 含量

工程菌基因組 DNA 的 A260/A280比值為 1.82，微量核酸測(cè)定儀測(cè)定濃度為 856 ng/μl。電泳結(jié)果如圖 1 所示，制備的基因組 DNA 完整性較好，純度較高，符合實(shí)驗(yàn)要求。

圖1 工程菌基因組 DNA 瓊脂糖凝膠電泳圖譜

2.2 探針標(biāo)記效率的檢測(cè)

2.2.1 超聲處理制備小片段 DNA 基因組 DNA 經(jīng)不同次數(shù)超聲處理后的電泳結(jié)果顯示：超聲次數(shù)越多，基因組DNA 片段越?。怀?2 次得到 100 bp～5 kb 的 DNA 片段；超聲 4 次得到 100 bp～1 kp 的 DNA 片段（圖 2）。

2.2.2 DNA 片段大小對(duì)探針標(biāo)記效率的影響 制備的探針進(jìn)行有效性檢測(cè)，通過比較標(biāo)記探針和對(duì)照探針顯色程度，從而確定 DNA 片段大小對(duì)標(biāo)記率的影響。超聲多次得到的 DNA 片段標(biāo)記所得探針（圖 3A），只能檢測(cè)到10 pg 呈顯色反應(yīng)；而超聲 2 次所得 DNA 片段標(biāo)記的探針（圖 3B），顯色程度和對(duì)照探針（圖 3C）一致。以下試驗(yàn)中，均選擇 2 次超聲處理的 DNA 片段作為模板進(jìn)行探針標(biāo)記。超聲次數(shù)過多，會(huì)使 DNA 片段過小，探針的標(biāo)記效率反而更低。

圖2 超聲處理 DNA 電泳檢測(cè)圖

圖3 超聲次數(shù)對(duì) DNA 標(biāo)記效率的影響

圖4 DNA 片段純度對(duì)標(biāo)記效率的影響

2.2.3 DNA 片段純度對(duì)探針標(biāo)記效率的影響 檢測(cè)結(jié)果如圖 4 所示，未純化探針（圖 4A）的標(biāo)記效率明顯低于純化探針（圖 4B），純化處理后的探針能夠在 0.3 pg 呈顯色反應(yīng)，而未處理的探針只能檢測(cè)到 3 pg 的反應(yīng)點(diǎn)。試驗(yàn)結(jié)果顯示，選擇純化處理的探針能達(dá)到更高的標(biāo)記效率。

2.3 樣品不同處理方法檢測(cè)結(jié)果對(duì)比

陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)品及供試品溶液、陽(yáng)性樣品經(jīng)不同方法處理后，用標(biāo)記好的探針進(jìn)行雜交，檢測(cè) DNA 殘留量，檢測(cè)結(jié)果如圖 5 所示，表明蛋白酶 K 處理后用 DNA 純化試劑盒回收的樣品檢測(cè)靈敏度明顯提高；加樣回收的陽(yáng)性樣品顯色均與相應(yīng)的陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)顯色相當(dāng)，證明供試品溶液蛋白并無(wú)對(duì) DNA 雜交反應(yīng)造成干擾，即驗(yàn)證了試驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性。

2.4 TNHH 原液中外源性 DNA 殘留量的檢測(cè)

圖5 樣品不同處理方法對(duì)檢測(cè)結(jié)果的影響

圖6 3 批次 TNHH 原液宿主 DNA 殘留量檢測(cè)圖

檢測(cè) 3 個(gè)批次的 TNHH 原液，首先制備陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)DNA 梯度溶液，同時(shí)制備同系列梯度的陽(yáng)性樣品，即參照1.2.5.1 陽(yáng)性樣品的制備方法；標(biāo)準(zhǔn)及樣品經(jīng)蛋白酶 K 酶切后，用 DNA 純化試劑盒進(jìn)行回收處理，然后進(jìn)行雜交顯色。檢測(cè)結(jié)果如圖 6 所示，3 批原液正常用劑量的外源性DNA 殘留量均小于 10 ng，且陽(yáng)性樣品組（圖 6B）與陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)組（圖 6A）梯度顯色結(jié)果基本一致，表明供試品溶液自身不干擾其中 DNA 殘留量的測(cè)定。故 3 批次供試品均符合 2010年版《中國(guó)藥典》三部中有關(guān)工程菌 DNA 殘留量的質(zhì)控要求。

3 討論

本研究利用地高辛標(biāo)記工程菌 DNA 片段作探針，通過分子雜交和免疫顯色檢測(cè)重組 TNHH 原液中殘余DNA，并優(yōu)化了實(shí)驗(yàn)方案，實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明此方法快速高效、重現(xiàn)性好?；蚬こ坍a(chǎn)品殘余 DNA 檢測(cè)受到很多因素影響，因此制備特異性強(qiáng)、靈敏度高的探針及恰當(dāng)大小的模板已成為關(guān)鍵步驟。通過實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，地高辛標(biāo)記探針法測(cè)定 DNA 的殘留量有著特異性高、操作簡(jiǎn)便和重現(xiàn)性好的特點(diǎn)，可以用于注射用 TNHH 生產(chǎn)過程中的質(zhì)量監(jiān)控，符合國(guó)家制定的相關(guān)質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)。

利用超聲所得 100 bp～5 kb 基因組 DNA 作為模板進(jìn)行探針標(biāo)記，并對(duì)標(biāo)記探針純化處理，供試品、標(biāo)準(zhǔn)品及陽(yáng)性樣品經(jīng)蛋白酶 K 在 37 ℃ 下酶切作用 4 h，再用DNA 純化試劑盒進(jìn)行回收去除干擾蛋白，對(duì)雜交膜進(jìn)行免疫檢測(cè)后采用底物顯色法顯色，從而建立了靈敏度為 10 pg的宿主 DNA 殘留檢測(cè)方法。

探針片段的長(zhǎng)短、純度等影響探針標(biāo)記率的高低進(jìn)而對(duì)檢測(cè)結(jié)果有著至關(guān)重要的影響。地高辛進(jìn)行探針標(biāo)記是以隨機(jī)的方式進(jìn)行的，因此制備探針用的 DNA 片段不宜太長(zhǎng)，也不宜太短，實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明基因組 DNA 片段過小，反而會(huì)大大降低標(biāo)記率。在制備好探針后進(jìn)一步純化除去蛋白雜質(zhì)也是必要的，實(shí)驗(yàn)證明純化后標(biāo)記效率明顯提高。

微量殘余 DNA 的檢測(cè)受蛋白質(zhì)的干擾較大，由于蛋白質(zhì)含量遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于殘余 DNA，有可能導(dǎo)致假陽(yáng)性。排除蛋白質(zhì)對(duì)檢測(cè)的影響至關(guān)重要，采用蛋白酶 K 處理的方法，37 ℃ 作用 4 h 后 DNA 純化試劑盒回收除去大量蛋白質(zhì)后，再檢測(cè)殘余 DNA，證明試劑盒回收處理效果是最好的。同時(shí)設(shè)置陽(yáng)性樣品組作為對(duì)照，進(jìn)一步證明實(shí)驗(yàn)結(jié)果方法是可行的。

綜上所述，本文建立的地高辛標(biāo)記探針檢測(cè) TNHH 原液中宿主 DNA 殘留量的方法靈敏度高、特異性強(qiáng)、重現(xiàn)性好、操作相對(duì)簡(jiǎn)單且對(duì)人體無(wú)害，能夠滿足檢測(cè)和質(zhì)控的要求，同時(shí)本研究對(duì)實(shí)驗(yàn)條件優(yōu)化進(jìn)行摸索，為那些國(guó)內(nèi)尚無(wú)通過藥檢、無(wú)先例的生物制品的宿主 DNA 殘留量測(cè)定提供參考。

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