李鑫，劉卉秋，胡強，曹冬梅，曹際娟

遼寧出入境檢驗檢疫局，遼寧 大連 116001

番茄環(huán)斑病毒（Tomato ringspot Nepovirus，ToRSV）是線傳病毒組成員，可感染105 屬157 種草本和木本植物，主要感染果樹和漿果作物，屬我國對外的一類檢疫性有害生物。ToRSV 的檢測方法主要有生物學、血清學和電鏡技術(shù)，ELISA和PCR 是應(yīng)用最多的2 種檢測方法。但上述技術(shù)普遍存在對人員、環(huán)境要求高的問題，難以進行現(xiàn)場快速檢測。

免疫層析技術(shù)是上世紀90 年代發(fā)展起來的一種基于抗原抗體反應(yīng)的簡便快速檢測技術(shù)，該技術(shù)已廣泛應(yīng)用于臨床、食品安全檢測領(lǐng)域?，F(xiàn)有的免疫層析產(chǎn)品所使用的標記物多為膠體金和彩色乳膠顆粒，用這些顆粒制成的免疫層析試紙條可以用肉眼直接判讀結(jié)果，使用起來十分方便。但此類試紙條產(chǎn)品的靈敏性普遍較差，還不能滿足快速、高靈敏檢測的需要。稀土熒光納米顆粒含有稀土離子與螯合劑形成的螯合物，該螯合物可在紫外光激發(fā)下發(fā)射出特征性熒光。我們采用稀土熒光納米顆粒作為標記物研制的熒光納米顆粒試紙條，具有檢測更為快速、準確的特征，可廣泛應(yīng)用于ToRSV感染組織的現(xiàn)場快速檢測。

1 材料與方法

1.1 材料

熒光納米顆粒及ToRSV多克隆抗體購自深圳易瑞生物技術(shù)有限公司；牛血清白蛋白（BSA）購自生工生物工程（上海）股份有限公司；羊抗鼠IgG 購自中晶生物公司；硝酸纖維素膜、玻璃纖維素膜購自Millipore 公司；所用試劑均為分析純產(chǎn)品；檢測樣品由本中心保藏。

1.2 熒光顆粒單抗偶聯(lián)物的制備

取熒光顆粒50μL（10 mg/mL），加入550μL 50 mmol/L 的MES（pH6.0）、100 mg/mL 的sulfo-NHS和EDC 各200μL，室溫搖動30 min；離心，棄上清；用1 mL 50 mmol/L 的MES（pH6.0）重懸顆粒；加入適量單克隆抗體，室溫振搖1 h；加入等體積的PBSBSA（BSA 含量2%，pH7.4），繼續(xù)反應(yīng)1 h；離心，棄上清；用50 mmol/L 的MES（pH6.0）洗滌顆粒3 次，1 mL/次；用300μL 重懸液［10 mmol/L Tris-HCl（pH8.0），10%蔗糖］重懸顆粒，4℃保存，備用。

1.3 納米顆粒試紙條的制備

1.3.1 檢測線 以多克隆抗體為硝酸纖維素膜上的檢測線包被抗原。將稀釋好的包被抗原用點膜儀以1μL/cm 的量噴于粘在PVC 底板上的硝酸纖維素膜上，置干燥密閉的37℃真空烘箱內(nèi)烘烤60 min，取出后放在干燥皿中待用。

1.3.2 質(zhì)控線 以羊抗鼠IgG 包被硝酸纖維素膜，作為質(zhì)控線。將稀釋好的羊抗鼠IgG 用點膜儀以1μL/cm 的量噴于粘在PVC 底板上的硝酸纖維素膜上，置干燥密閉的37℃真空烘箱內(nèi)烘烤60 min，取出后放在干燥皿中待用。

1.3.3 試紙條裝配 在硝酸纖維素膜的兩端分別粘貼吸水墊和樣品墊，吸水墊和樣品墊均與NC膜重疊3 mm。裁成5 mm寬的條狀，4℃干燥保存。

1.4 試紙條特異性的檢測

1.4.1 樣品提取 取1 g 待檢物葉片于潔凈塑料袋中，加 入3 mL PBST（1×PBS，0.5% Tween-20，pH7.4），揉搓塑料袋中的葉片，所得汁液即為待測樣本。采用小西葫蘆花葉病毒（ZYMV）、黃瓜花葉病毒（CMV）、煙草花葉病毒（TMV）、番木瓜環(huán)斑病毒（PRSV）、南瓜花葉病毒（SqMV）、煙草環(huán)斑病毒（TRSV）、甜瓜壞死斑點病毒（MNSV）和黃瓜綠斑駁花葉病毒（CGMMV）作為特異性檢測的參照，取樣方法同上。

1.4.2 檢測 在反應(yīng)杯中加入4μL熒光顆粒-單抗偶聯(lián)物、200μL提取物（汁液），吹打混勻10次，40℃孵育3 min，插入試紙條繼續(xù)反應(yīng)5 min，紫外光下肉眼觀察結(jié)果。

1.5 試紙條穩(wěn)定性的檢測

將試紙條和熒光顆粒及提取液（1×PBST）于37℃放置7 d，每天檢測陽性樣品，觀察其穩(wěn)定性。

1.6 熒光試紙條與膠體金試紙條靈敏性比較

1.6.1 膠體金試紙條的制備 膠體金試紙條的制備參照Frens的方法[1]。檢測時在反應(yīng)杯中加入適量膠體金-單抗偶聯(lián)物、200μL提取物（汁液），吹打混勻10 次，40℃孵育3 min，插入試紙條繼續(xù)反應(yīng)5 min，肉眼判讀結(jié)果。

1.6.2 靈敏性比對試驗 用PBST 將同一份陽性樣本分別稀釋至1/8、1/16、1/32、1/64、1/128，分別用膠體金和免疫層析方法進行檢測。

2 結(jié)果

2.1 熒光納米顆粒試紙條的制備

試紙條裝配結(jié)構(gòu)如圖1。在底板上依次緊密搭接的樣品墊7、層析膜8和吸水墊9；層析膜8 上設(shè)有檢測區(qū)81和質(zhì)控區(qū)82，檢測區(qū)81 固定有與ToRSV發(fā)生特異性反應(yīng)的多克隆抗體，質(zhì)控區(qū)82 固定有羊抗鼠IgG。

2.2 特異性檢測結(jié)果

用制備的熒光納米顆粒試紙條檢測ToRSV及其他8 種參照病毒的陽性樣本，除ToRSV 外，其余均無交叉反應(yīng)。典型實驗結(jié)果如圖2所示。

2.3 穩(wěn)定性檢測結(jié)果

將試紙條和熒光顆粒及提取液（1×PBST）于37℃放置7 d，進行連續(xù)檢測試驗，結(jié)果表明試紙條和熒光顆粒及反應(yīng)液的靈敏性沒有明顯降低，表明該試紙條的穩(wěn)定性較好。

2.4 熒光試紙條與膠體金試紙條靈敏性比對

靈敏度對比試驗結(jié)果（表1）顯示，當陽性樣本稀釋至1/32時，膠體金試紙條不能觀測到顯色反應(yīng)，而熒光試紙條仍可檢出；當稀釋到1/64時，熒光試紙條無任何反應(yīng)。由此可以看出，熒光納米顆粒試紙條對樣品的濃度要求要低于普通膠體金試紙條，其有較高的靈敏性。

圖1 試紙條裝配結(jié)構(gòu)圖

圖2 典型實驗結(jié)果（紫外光下）

表1 不同方法的靈敏性比對

3 討論

目前，雖然已經(jīng)有一些用免疫層析試紙條檢測微生物的報道[2-3]，但靈敏性都不夠理想，標記物的信號強度弱是一個很重要的原因。熒光納米顆粒中含有多個熒光顆粒，具有良好的發(fā)光性能，熒光信號也遠遠強于傳統(tǒng)的標記物質(zhì)。本研究將免疫層析技術(shù)和熒光納米顆粒標記技術(shù)相結(jié)合，建立了番茄環(huán)斑病毒的免疫層析檢測法。該方法的原理、操作過程和結(jié)果判讀與膠體金免疫層析試紙條相似，但熒光納米顆粒試紙條在傳統(tǒng)膠體金結(jié)構(gòu)上進行了改進，將原來的可結(jié)合膠體金顆粒的結(jié)合墊取消，改為將熒光顆粒與待測樣品相混合的方式，使其充分反應(yīng)，完全擯棄了膠體金依靠被動物理吸附的標記方式，從而提高了檢測效率及熒光信號的強度。目前該試紙條已獲國家實用新型專利（ZL201320706434.4）。

免疫學檢測技術(shù)在植物病毒檢測中具有靈敏、特異、簡便、高通量等優(yōu)勢，因此得以廣泛應(yīng)用[4]。近20 年來，不斷有一些新的免疫學檢測技術(shù)被應(yīng)用于微生物的檢測中，如時間分辨熒光技術(shù)（TRFIA）[5]、酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）[6-7]、膠體金免疫層析技術(shù)（GCIA）[8]等。高強度的熒光信號保證了檢測方法具有良好的靈敏性，且穩(wěn)定性試驗結(jié)果說明本研究所建立的免疫層析檢測系統(tǒng)亦具有良好的穩(wěn)定性。

番茄環(huán)斑病毒熒光納米顆粒檢測試紙條的研制成功，為該病毒的快速檢測提供了一個極好的檢測方法，便于現(xiàn)場或田間檢測的開展，為生物安全工作提供了便利，也有助于其他植物病毒或微生物的快速檢測方法研究。

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