張金龍 ，李冰，2，任軍，宋曉紅，張章，侯利華，于長明，付玲，楊秀旭，李建民

1.軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院生物工程研究所 疫苗與抗體工程研究室，北京 100071；2.解放軍306醫(yī)院 檢驗(yàn)科，北京 100000

炭疽是炭疽芽孢桿菌引起的人畜共患重大烈性傳染病。炭疽芽孢由于其強(qiáng)烈的致病力和極強(qiáng)的對(duì)環(huán)境的適應(yīng)能力，一直被作為重要的生物戰(zhàn)劑及生物恐怖劑[1]。炭疽芽孢桿菌外毒素由保護(hù)性抗原（protective antigen，PA）、致死因子（lethal factor，LF）和水腫因子（edema factor，EF）3 種多肽組成[2-4]。針對(duì)PA 的單克隆抗體具有良好的保護(hù)性和安全性[5]，且其半衰期長、性質(zhì)穩(wěn)定，是目前最有前景的炭疽毒素抑制劑[6-7]。我們利用自主構(gòu)建的表達(dá)抗PA 的人源化抗體的重組CHO 細(xì)胞，嘗試建立并優(yōu)化大規(guī)模哺乳動(dòng)物細(xì)胞發(fā)酵后純化工藝，并對(duì)所獲得的產(chǎn)品的純度和活性進(jìn)行檢測(cè)，為抗炭疽人源化抗體的生產(chǎn)及質(zhì)量控制打下基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 材料

表達(dá)重組抗炭疽PA 人源化抗體的CHO 細(xì)胞株為本室構(gòu)建保存[8-9]；小鼠巨噬細(xì)胞系J774A.1 由本室保存；層析介質(zhì)MabSelect Sure、SP-Sepharose Fast Flow、Sephadex G25，蛋白質(zhì)純化系統(tǒng)AKTA purifier 購自GE 公司；Waters 2487/2695 HPLC 系統(tǒng)購自Waters 公司；TSK G3000 SWXL（7.8 mm×300 mm）購自TOSOH 公司；0.45 μm 微孔濾器、30kD 超濾系統(tǒng)購自Millipore公司。

1.2 發(fā)酵液處理

重組CHO 細(xì)胞培養(yǎng)液共50 L，經(jīng)12 000 r/min離心15 min，收集上清液，用0.45 μm 微孔濾膜過濾，采用截留分子量為30kD 的濾膜超濾濃縮，得到約20 L超濾濃縮液。

1.3 MabSelect Sure親和層析

用5 倍柱體積的緩沖液A（20 mmol/L PB，0.15 mol/L NaCl，pH7.0）平衡親和層析柱，將超濾濃縮后的細(xì)胞培養(yǎng)液以200 mL/min 的流速上樣，上樣完畢后用緩沖液A 平衡層析柱，檢測(cè)波長280 nm，至基線后，用緩沖液B（0.1 mol/L 甘氨酸-HCl，0.15 mol/L NaCl，pH4.2）洗滌去除雜蛋白后，用緩沖液C（0.1 mol/L甘氨酸-HCl，0.15 mol/L NaCl，pH3.2）洗脫，收集洗脫液，靜置3 h，滅活病毒后，用1 mol/L Tris（pH9.0）中和至pH5.6。

1.4 SP-Sepharose FF陽離子交換層析

用5 倍柱體積的緩沖液D（50 mmol/L NaAc，pH5.6）平衡SP-Sepharose FF 陽離子交換層析柱，中和后的親和層析洗脫液稀釋至1/4后上樣，用緩沖液D 平衡層析柱，檢測(cè)波長280 nm，至基線后，用緩沖液E（50 mmol/L NaAc，0.25 mol/L NaCl，pH5.6）洗脫，收集洗脫液，層析介質(zhì)以1 mol/L NaOH 在位清洗，全過程流速50 mL/min。

1.5 Sephadex G25置換緩沖液

用5 倍體積的緩沖液A 平衡Sephadex G25 分子排阻層析柱，SP 陽離子洗脫蛋白質(zhì)樣品上樣，收集目標(biāo)峰，全過程完成后，層析介質(zhì)以1 mol/L NaOH在位清洗，全過程流速50 mL/min。

1.6 蛋白質(zhì)含量檢測(cè)

發(fā)酵液上清中抗體蛋白質(zhì)含量采用ELISA 法估算；其他純化過程中蛋白質(zhì)含量采用紫外法檢測(cè)：采用島津UV-1601 紫外分光光度計(jì)，先用相應(yīng)空白緩沖液歸零，然后將抗炭疽人源化抗體稀釋至D280nm值為0.3～0.8，分別精確測(cè)定D280nm及D320nm值，每個(gè)樣品測(cè)定3 次，取平均值，而后按照下式計(jì)算蛋白濃度（式中的抗炭疽人源化抗體的紫外光吸收系數(shù)為1.503）：

1.7 SDS-PAGE法檢測(cè)蛋白質(zhì)相對(duì)分子質(zhì)量

采用還原型SDS-PAGE。取20 μg 抗體，加入等體積2×上樣緩沖液（含終濃度為1%的巰基乙醇），混勻后煮沸5 min。電泳結(jié)束后常規(guī)考馬斯亮藍(lán)染色，脫色后掃描分析結(jié)果。

1.8 SEC-HPLC檢測(cè)純度

采用Waters 2487/2695 高效液相色譜系統(tǒng)，分析柱為TSK G3000 SWXL 流動(dòng)相為0.2 mol/L 磷酸鹽加0.15 mol/L NaCl（pH6.8），流速0.8 mL/min，上樣量50 μg，檢測(cè)280 nm 波長處吸收峰，譜圖結(jié)果用Empower 2軟件分析。

1.9 Western印跡

取PA 及等量牛血清白蛋白（BSA，作為陰性對(duì)照）進(jìn)行非還原型SDS-PAGE。用100 mA恒流電轉(zhuǎn)3 h 將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)至PVDF 膜上，用3% BSA 室溫封閉2 h，加入用封閉液按1∶10 000 稀釋的抗炭疽人源化抗體，37℃孵育2 h，用TBST 洗膜3 次，加入用封閉液按1∶5000 稀釋的HRP 標(biāo)記的羊抗人Fc 二抗，37℃孵育1 h，用TBST洗膜3次，化學(xué)發(fā)光法顯色。

1.10 體外細(xì)胞保護(hù)試驗(yàn)

J774A.1 細(xì)胞以2×105/mL 接種于96 孔細(xì)胞培養(yǎng)板，長至90%匯合后吸棄孔中培養(yǎng)液上清；將用培養(yǎng)液梯度稀釋的抗體與100 ng/mL PA 和100 ng/mL LF 于37℃共孵育1 h 后加入細(xì)胞培養(yǎng)孔中，37℃孵育3 h，加入25 μL MTT（5 mg/mL），37℃孵育30 min，吸棄上清，每孔加入100 μL 鹽酸異丙醇，振蕩至沉淀溶解，測(cè)定各孔的D570nm值。以只加單純新鮮培養(yǎng)基為全部存活對(duì)照孔，以未加抗體、只加PA 和LF 的培養(yǎng)液為全部死亡對(duì)照孔，D570nm值高于死亡對(duì)照孔0.1以上的細(xì)胞孔判為存活，此時(shí)的最大稀釋度定義為TNA（毒素中和試驗(yàn)）效價(jià)。結(jié)果取2 個(gè)復(fù)孔的平均值。

1.11 其他檢測(cè)

委托軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院儀器測(cè)試分析中心采用MOLDI-TOF 法測(cè)定抗體蛋白質(zhì)的相對(duì)分子質(zhì)量（Mr）；蛋白A 殘留檢測(cè)采用試劑盒（Cygnus Technologies，F(xiàn)050）法；宿主蛋白質(zhì)殘留檢測(cè)采用試劑盒（Cygnus Technologies，CM015）法；內(nèi)毒素等的檢測(cè)采用中國藥典（2010版）方法。

2 結(jié)果

2.1 分離純化及得率分析

MabSelect SuRe 親和層析初步捕獲抗體蛋白質(zhì)（圖1）；SP-Sepharose FF 陽離子交換層析實(shí)現(xiàn)了雜質(zhì)蛋白、抗體蛋白質(zhì)多聚體及色素的分離（圖2）；Sephadex G25 分子篩層析實(shí)現(xiàn)了緩沖液的交換（圖3）。各步得率見表1，總蛋白質(zhì)得率為61.7%。

2.2 SEC-HPLC檢測(cè)抗體純度

SEC-HPLC 檢測(cè)抗體純度結(jié)果見圖4，主峰保留時(shí)間8.608 min，百分比面積為99.25。故該法檢測(cè)所得抗體純度為99.25%。肩峰為二聚體，所占面積比例為0.75%。

2.3 蛋白質(zhì)相對(duì)分子質(zhì)量檢測(cè)

圖1 MabSelect SuRe親和層析色譜圖

圖2 SP-Sepharose FF離子交換層析色譜圖

表1 目的蛋白質(zhì)純化各步效率及得率

抗體包括2條重鏈和2條輕鏈，其中成熟重鏈由452 個(gè)氨基酸殘基組成，理論Mr為49 717；輕鏈由213 個(gè)氨基酸殘基組成，理論Mr為23 219；還原SDS-PAGE 表明二者M(jìn)r均基本符合預(yù)期（圖5）。MOLDI-TOF檢測(cè)Mr為147 995，與預(yù)期相符（圖6）。

2.4 Western印跡結(jié)果

Western 印跡結(jié)果見圖7，可見抗體特異性地與PA發(fā)生結(jié)合。

圖3 Sephadex G25凝膠過濾層析色譜圖

圖4 SEC-HPLC法檢測(cè)抗體純度色譜圖

圖5 SDS-PAGE法檢測(cè)蛋白質(zhì)相對(duì)分子質(zhì)量

圖6 MOLDI-TOF法檢測(cè)蛋白質(zhì)相對(duì)分子質(zhì)量

2.5 體外細(xì)胞保護(hù)試驗(yàn)

細(xì)胞存活率與抗體加入濃度有明顯的相關(guān)性，采用四參數(shù)法擬合曲線見圖8，并計(jì)算出該抗體的EC50值為0.1516 μg/mL。

2.6 其他檢測(cè)

經(jīng)檢測(cè)，蛋白A 含量為0.63 ng/mg 抗體，符合規(guī)定（≤0.01%）；宿主蛋白殘留量為0.62 ng/mg 抗體，符合規(guī)定（≤0.01%）；內(nèi)毒素含量等均符合中國藥典規(guī)定。

圖7 Western印跡鑒定PA的抗體結(jié)合特異性

圖8 PA細(xì)胞毒性中和作用實(shí)驗(yàn)

3 討論

我們收集了激流式生物反應(yīng)器所培養(yǎng)的CHO細(xì)胞發(fā)酵液上清，并采用Mabselect Sure 親和層析、SP-Sepharose FF，通過精確控制純化條件，實(shí)現(xiàn)了對(duì)抗炭疽人源化抗體的初步分離純化?，F(xiàn)在大多數(shù)廠家的分離純化工藝是發(fā)酵后進(jìn)行深層過濾獲得澄清的上清，第一步進(jìn)行親和層析，層析后產(chǎn)物進(jìn)行低pH 放置滅活病毒，經(jīng)過濾后進(jìn)行陰離子層析除去殘余DNA 和內(nèi)毒素，流穿液進(jìn)行陽離子層析去除聚集體，洗脫產(chǎn)物進(jìn)行納濾去除病毒的工藝，再經(jīng)過超濾和除菌過濾獲得原液。相比之下，我們的現(xiàn)有工藝略顯粗糙，還須進(jìn)一步完善。例如，離心法澄清不適用于大規(guī)模生產(chǎn)，但可以通過簡單地將離心操作轉(zhuǎn)換為深層過濾或中空纖維柱微濾澄清，便可滿足各種規(guī)模的生產(chǎn)需要。另外，還須進(jìn)一步進(jìn)行病毒的滅活/去除工藝研究。

單抗藥物的質(zhì)量要求是生物制品中比較高的，也是比較難進(jìn)行質(zhì)控的[10]。需要進(jìn)行產(chǎn)品相關(guān)雜質(zhì)（分子大小和電荷異構(gòu)體）、工藝相關(guān)雜質(zhì)（殘余宿主蛋白、殘余DNA 和泄漏的蛋白A 配基）、蛋白含量和生物活性、鑒別試驗(yàn)和安全性（內(nèi)毒素和無菌）等研究[11]?，F(xiàn)有質(zhì)量研究數(shù)據(jù)基本確認(rèn)表達(dá)了正確的具有生物學(xué)活性的完整單抗，質(zhì)量控制則須進(jìn)一步完善。需要建立Q-PCR 法檢測(cè)殘余DNA、離子高效液相色譜法考察電荷的異質(zhì)性及HPLC 方法分析糖型等檢測(cè)方法。

目前，炭疽的治療主要依靠抗菌素[12]，但在臨床上往往由于服用不及時(shí)、自然產(chǎn)生的或因?qū)μ烤揖娜藶楦臉?gòu)而產(chǎn)生的耐藥性，使得抗菌素不能奏效，而抗PA 的人源化抗體在感染各期均可以對(duì)炭疽桿菌起的殺傷作用。美國政府非常重視炭疽的防控研究，早在2012年FDA 就批準(zhǔn)人類基因組科學(xué)公司研制的Abthrax（raxi-bacumab）上市，用于炭疽的治療。目前國內(nèi)尚無同類用于急救的抗炭疽毒素藥物。本研究基于本室前期研究結(jié)果，為抗炭疽人源化抗體的規(guī)?；a(chǎn)及質(zhì)控工作打下了基礎(chǔ)。

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