樊愛琳，馬越云，鄭善鑾，楊麥貴，郝曉柯

第四軍醫(yī)大學 西京醫(yī)院檢驗科，陜西 西安 710032

結(jié)核病是危害人類健康的重要傳染病，我國的肺結(jié)核患者數(shù)量位居世界第二。結(jié)核分枝桿菌（Mycobacterium tuberculosis，MTB）感染人體后，絕大多數(shù)以潛伏感染（休眠菌）的形式存在。現(xiàn)有的抗結(jié)核藥物可以有效殺死處于生長狀態(tài)的結(jié)核分枝桿菌，但對處在休眠狀態(tài)的結(jié)核分枝桿菌效果甚微。當患者的抵抗力低下時，休眠的MTB 就會大量繁殖，重新處于致病狀態(tài)[1-2]。

研究發(fā)現(xiàn)，在MTB 休眠菌的復(fù)蘇過程中，5 種促進復(fù)活因子（resuscitation promoting factor，Rpf）發(fā)揮了重要作用，它們分別為RpfA、RpfB、RpfC、RpfD和RpfE[3]，是由MTB分泌的。Rpf最早在藤黃微球菌（Micrococcus luteus）中被發(fā)現(xiàn)[4]，它也是發(fā)現(xiàn)的第一個能夠促使休眠菌恢復(fù)生長繁殖能力的分泌型蛋白，是宿主免疫系統(tǒng)識別的靶抗原，其產(chǎn)生的特異性抗體能阻斷Rpf 蛋白對MTB 休眠菌的復(fù)蘇作用，因此Rpf 蛋白可能是預(yù)防和控制MTB 感染的新途徑。同源性分析發(fā)現(xiàn)，在多種富含G+C 的革蘭陽性細菌中有Rpf樣蛋白存在，均具有Rpf樣結(jié)構(gòu)域[4]。Rpf蛋白結(jié)構(gòu)域是一個含77 個氨基酸殘基的截斷肽，位于Rpf 蛋白全長的A42～L118。研究發(fā)現(xiàn)Rpf 蛋白結(jié)構(gòu)域具有與Rpf 蛋白一致的生物學功能，其體外復(fù)活休眠菌的作用與完整的Rpf蛋白相同，也具有Rpf蛋白相似的免疫原性，誘導產(chǎn)生的特異性抗體可能會阻斷MTB的Rpf家族的全部Rpf樣蛋白，抑制細菌的復(fù)蘇和生長[5]。MTB的5種Rpf樣蛋白功能重疊[6]，實驗表明敲除其中任何一個Rpf 基因時，其生長不會受到明顯影響[7]。這表明MTB 的5 種Rpf 樣蛋白存在協(xié)同作用，共同對MTB 的休眠進行控制。因此，如何對其進行優(yōu)化組合將成為疫苗研發(fā)及實驗室檢測方法建立的重要障礙。研究表明，RpfB 在MTB 的生長中發(fā)揮較為重要的作用。RpfB 蛋白為膜蛋白，具有多種T 細胞和B 細胞抗原表位，突變RpfB 可明顯減緩H37Ra 的生長速度[8]。本實驗室前期的研究也發(fā)現(xiàn)RpfB 具有較強的生物學和免疫學特性[9]。因此，RpfB 結(jié)構(gòu)域可能是研究MTB Rpf 蛋白免疫學特性及生物學功能的切入點。為此，我們以原核表達純化的RpfB 結(jié)構(gòu)域多肽作為免疫原，制備其單克隆抗體，為進一步研究其生物學和免疫學特性提供了重要工具。

1 材料和方法

1.1 材料

BALB/c 小鼠（雌性，6～8 周齡）由第四軍醫(yī)大學動物實驗中心提供；結(jié)核桿菌H37Ra 株為陜西省結(jié)核病防治研究所惠贈；藤黃微球菌標準株、大腸桿菌DH5α為西京醫(yī)院檢驗科細菌室保存；Sp2/0 細胞系由第四軍醫(yī)大學微生物教研室饋贈；pPRO-EXHTRpfB domain 重組質(zhì)粒為本實驗室制備[10]；PEG、HT及HAT 購自Promega 公司；6×His 單抗、HRP 山羊抗小鼠IgG 抗體購自華美生物公司；Ni2+-NTA 純化試劑盒購自Invitrogen公司。

1.2 結(jié)核分枝桿菌RpfB結(jié)構(gòu)域多肽的表達和純化

將pPRO-EXHT-RpfB domain 原核表達載體接種于大腸桿菌DH5，用0.5 mmol/L IPTG 誘導表達4 h，表達的融合蛋白經(jīng)SDS-PAGE 及Western 印跡鑒定，采用Ni2+-NTA 純化試劑盒按變性條件進行親和色譜純化目的蛋白，采取逐步降低尿素濃度的方法除去尿素，使變性蛋白自然復(fù)性。

1.3 單抗細胞株的建立

用純化的RpfB 結(jié)構(gòu)域多肽免疫BALB/c 小鼠3次，每次間隔2 周；采用PEG1500 融合劑，將免疫小鼠的脾細胞和骨髓瘤細胞Sp2/0 融合，用含HAT 的培養(yǎng)液培養(yǎng)融合細胞5 d，之后改用含HT 的培養(yǎng)液培養(yǎng)3 d 至第8 d，用間接ELISA 法檢測培養(yǎng)上清抗體效價，將陽性孔用有限稀釋法進行克隆化，建立單克隆細胞株。

1.4 含單抗腹水的制備及純化

將單克隆細胞株細胞密度調(diào)至1×109～2×109/L，進行小鼠腹腔注射制備腹水，每只小鼠注射0.5 mL，注射后10～15 d可發(fā)現(xiàn)小鼠腹部明顯膨大，抽取腹水，采用正辛酸-硫酸銨法進行純化。

1.5 間接夾心ELISA法檢測純化抗體效價

用10 g/L 的RpfB 結(jié)構(gòu)域多肽包被板子，加入系列稀釋的純化抗體，以HRP 標記的羊抗鼠為二抗，用OPD 顯色。以Sp2/0 細胞培養(yǎng)上清作為陰性對照，免疫小鼠血清作為陽性對照。

1.6 Western印跡鑒定純化單抗的特異性

將表達產(chǎn)物經(jīng)SDS-PAGE 后轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上，在37℃用50 g/L 脫脂奶粉封閉1 h，加入純化的單抗，濃度為100 mg/L，孵育1 h，用PBS 洗滌3次，再加入HRP-山羊抗小鼠IgG 抗體，37℃搖床孵育1 h，PBS洗滌3次，加入底物，用OPD顯色。

1.7 ELISA法檢測單抗的特異性

用RpfB結(jié)構(gòu)域多肽和無關(guān)的帶His標簽的融合蛋白同時包被板子，以純化的單抗作為一抗，37℃孵育1 h，PBS 洗滌后與1∶1000 稀釋的HRP-山羊抗小鼠IgG抗體37℃反應(yīng)1 h，PBS洗滌，OPD顯色。

1.8 ELISA法鑒定單抗類和亞類

用6 種類和亞類特異性羊抗鼠多克隆抗體檢測不含血清的雜交瘤細胞培養(yǎng)上清，呈陽性反應(yīng)的即可確定型別。

1.9 單抗相對親和力測定

包被RpfB 結(jié)構(gòu)域2 mg/L，4℃過夜，洗滌后用10%小牛血清封閉1 h，加入系列稀釋（200～10-7μg/mL）的純化單抗孵育1 h，PBS洗滌后與1∶1000稀釋的HRP-山羊抗小鼠IgG 反應(yīng)1 h，洗滌后用OPD 顯色，讀取D490nm值并繪制曲線，觀察相對親和力。

1.10 抗RpfB結(jié)構(gòu)域單抗的交叉實驗

分別用藤黃微球菌Rpf、Rpf 結(jié)構(gòu)域、MTB RpfB結(jié)構(gòu)域和MTB RpfA、H37Ra 菌株作為抗原包被板子，以制備的單抗（選取效價最高的一株B8G11）作為一抗，用ELISA 法檢測，觀察抗RpfB 結(jié)構(gòu)域單抗與Rpf家族蛋白及MTB的交叉反應(yīng)。

1.11 抗RpfB結(jié)構(gòu)域單抗的抑制實驗

取休眠狀態(tài)的MTB H37Ra 100 μL 轉(zhuǎn)接到5 mL 7H9培養(yǎng)基中，藤黃微球菌100 μL轉(zhuǎn)接到5 mL葡萄糖肉湯液體培養(yǎng)基中，分別加入不同濃度的RpfB結(jié)構(gòu)域蛋白和抗RpfB結(jié)構(gòu)域單抗，以0.01 mol/L PBS為陰性對照，每個濃度重復(fù)5管，37℃培養(yǎng)，每3 h（27 h 后每6 h）取少量藤黃微球菌培養(yǎng)液測D600nm值，每5 d取少量MTB H37Ra株培養(yǎng)液測D600nm值，繪制各組MTB H37Ra和藤黃微球菌生長曲線。

2 結(jié)果

2.1 RpfB結(jié)構(gòu)域蛋白的表達和純化

原核系統(tǒng)表達的RpfB 結(jié)構(gòu)域蛋白為不可溶性的，SDS-PAGE 分析表明在Mr約為12×103處有蛋白表達帶，與目的蛋白大小吻合。在變性條件下純化目的蛋白，收集洗脫液進行160 g/L SDS-PAGE 分析，發(fā)現(xiàn)在Mr為12×103處有清晰的條帶，經(jīng)薄層掃描分析融合蛋白純度可達90%以上（圖1）。

2.2 抗Rpf結(jié)構(gòu)域單抗的制備及鑒定

取小鼠骨髓瘤細胞Sp2/0 與已免疫小鼠的脾細胞融合，融合后第8 d用間接ELISA 法檢測，有20孔為陽性，用有限稀釋法進行克隆化，經(jīng)過3 次克隆化得到3 株可穩(wěn)定分泌單抗的雜交瘤細胞系，分別命名為D3A5、B8G11、A9C8，其中D3A5、B8G11 屬IgG1亞類，A9C8 屬IgM 亞類。3 株單抗腹水純化后顯著增高（表1），Western 印跡分析表明該單抗可特異性識別RpfB 結(jié)構(gòu)域多肽（圖2）。ELISA 結(jié)果顯示，帶His 標簽的無關(guān)蛋白檢測為陰性，而RpfB 結(jié)構(gòu)域檢測為陽性，說明所獲得的單抗是針對RpfB 結(jié)構(gòu)域的，不是針對His標簽的。根據(jù)間接ELISA檢測系列稀釋的單抗與RpfB 結(jié)構(gòu)域反應(yīng)的D490nm值繪制曲線,以抗原抗體結(jié)合平臺期50%的D490nm值的抗體濃度表示單抗的相對親和力，結(jié)果D3A5、B8G11、A9C8的相對親和力分別為0.1、1和0.05 μg/mL，即A9C8＞D3A5＞B8G11（圖3）。

圖1 結(jié)核分枝桿菌RpfB結(jié)構(gòu)域融合表達蛋白的SDS-PAGE分析

表1 D3A5、B8G11、A9C8單抗效價

2.3 抗RpfB結(jié)構(gòu)域單抗的交叉實驗

從表2 可以看出，抗RpfB 結(jié)構(gòu)域單抗可以與MTB RpfB 結(jié)構(gòu)域、MTB RpfA、藤黃微球菌Rpf、Rpf結(jié)構(gòu)域、H37Ra 菌株發(fā)生反應(yīng)，說明抗RpfB 結(jié)構(gòu)域單抗可識別Rpf樣蛋白及其結(jié)構(gòu)域。

2.4 抗RpfB結(jié)構(gòu)域單抗對MTB的生長抑制作用

圖2 純化單抗的Western印跡

圖3 抗RpfB結(jié)構(gòu)域單抗的相對親和力

表2 ELISA法檢測抗RpfB結(jié)構(gòu)域單抗的交叉實驗

從不同濃度的RpfB 結(jié)構(gòu)域蛋白刺激藤黃微球菌和MTB H37Ra 的生長曲線可以看出，當RpfB 結(jié)構(gòu)域濃度為1000 pmol/L 時刺激藤黃微球菌的復(fù)蘇和生長作用明顯，當RpfB 結(jié)構(gòu)域濃度為500 pmol/L時刺激MTB H37Ra的復(fù)蘇和生長作用明顯，而且這種刺激作用在加入了1∶1000 的抗RpfB 結(jié)構(gòu)域單抗后明顯被抑制（圖4、5）。

3 討論

結(jié)核分枝桿菌感染率很高，多數(shù)感染者并不發(fā)病，是因為MTB 以休眠體狀態(tài)存在于體內(nèi)。Rpf 最先在藤黃微球菌中發(fā)現(xiàn)[5]，它在細胞外以皮克（10-12g）水平通過自分泌和旁分泌形式發(fā)揮促進休眠期細菌復(fù)活的作用。MTB含有5種Rpf樣蛋白，在功能上有一定的重疊，刪除任何一個編碼Rpf 蛋白的基因都不能明顯影響MTB 的生長，而當3 個以上基因被刪除時，MTB 在體外才不能自發(fā)復(fù)蘇[7]。提示單個抗Rpf 抗體并不能完全阻斷所有Rpf 蛋白對結(jié)核菌復(fù)蘇和生長的促進作用，只有3個以上抗Rpf抗體聯(lián)合應(yīng)用才能有效阻斷Rpf 蛋白對結(jié)核菌的促復(fù)蘇和生長作用。但如何對其進行優(yōu)化組合，成為疫苗研發(fā)及實驗室檢測方法建立的重要障礙。

Vladimir 等的研究表明，藤黃微球菌Rpf 蛋白具有很強的免疫原性，用其免疫C57BL/6 小鼠后，可誘發(fā)T細胞增殖，引起IL-10、IL-12、γ-干擾素升高，其免疫血清可以抑制MTB H37Ra 的生長與增殖[11]。研究發(fā)現(xiàn)，藤黃微球菌的Rpf蛋白與其Rpf蛋白結(jié)構(gòu)域具有一致的生物學功能[12]。Rpf 蛋白結(jié)構(gòu)域可能是一種理想的保護性抗原。

我們利用原核系統(tǒng)表達獲得了RpfB 結(jié)構(gòu)域蛋白，將純化的蛋白作為免疫原免疫小鼠，制備了3 株單克隆抗體，特異性高，親和力較強，經(jīng)小鼠腹腔注射制備腹水純化后獲得了較高純度的單抗，可識別多種Rpf 樣蛋白及其結(jié)構(gòu)域蛋白。由于Rpf 樣蛋白高度同源、Rpf樣蛋白結(jié)構(gòu)域高度保守[12]，因此，推測抗RpfB 結(jié)構(gòu)域單抗可能會識別MTB Rpf 家族的全部Rpf 樣蛋白，這種推測有待于進一步驗證。據(jù)此，有可能建立MTB 相關(guān)抗原的檢測方法，可以檢測處于不同感染階段的MTB Rpf 蛋白，這樣不僅可以克服Rpf 蛋白表達具有時相性難以檢測的缺陷，又達到了多種抗原聯(lián)合檢測的目的，可以提高MTB 檢測的敏感性和特異性。

在觀察RpfB 結(jié)構(gòu)域蛋白對藤黃微球菌和MTB H37Ra 休眠菌促復(fù)蘇和生長作用的同時，我們還觀察了抗RpfB 結(jié)構(gòu)域單抗對這種促復(fù)蘇和生長的抑制作用。結(jié)果顯示，抗RpfB 結(jié)構(gòu)域單抗可明顯抑制RpfB 結(jié)構(gòu)域蛋白對MTB H37Ra 和藤黃微球菌休眠菌的復(fù)蘇和生長作用。表明RpfB 蛋白結(jié)構(gòu)域誘導的特異性抗體可能會抑制機體內(nèi)潛伏感染的MTB的再次激活，具有控制隱性感染復(fù)發(fā)的作用。抗RpfB結(jié)構(gòu)域單抗的制備，為進一步研究RpfB結(jié)構(gòu)域的生物學和免疫特性，評價其是否可作為候選結(jié)核亞單位疫苗的組分提供了實驗工具。

圖4 藤黃微球菌在RpfB結(jié)構(gòu)域蛋白及抗RpfB結(jié)構(gòu)域單抗作用下的生長曲線

圖5 MTB H37Ra在RpfB結(jié)構(gòu)域蛋白及抗RpfB結(jié)構(gòu)域單抗作用下的生長曲線

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