王昊欣，王霄旸，張麗芳，鄭文麗，費(fèi)陳忠，張可煜，王 米，李 濤，王春梅，肖 遂，薛飛群

(中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院上海獸醫(yī)研究所，中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院獸藥安全評(píng)價(jià)與殘留研究重點(diǎn)開放實(shí)驗(yàn)室，農(nóng)業(yè)部動(dòng)物寄生蟲學(xué)重點(diǎn)開放實(shí)驗(yàn)室動(dòng)物藥學(xué)研究室，上海200241)

球蟲病是危害養(yǎng)禽業(yè)的重大原蟲病，目前球蟲病的防治主要依賴于三嗪類、磺胺類等抗球蟲藥物［1］。然而，當(dāng)前臨床上球蟲耐藥性普遍，防治效果越來越低下，亟需安全、高效、無交叉耐藥的新型抗球蟲藥物以應(yīng)對(duì)這一局面［2－3］。沙咪珠利是一種新型三嗪類抗球蟲藥，是由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院上海獸醫(yī)研究所動(dòng)物藥學(xué)研究室自主研發(fā)的新型抗球蟲化合物。已有研究結(jié)果顯示沙咪珠利不僅具有良好的抗球蟲效果(抗球蟲指數(shù) ACI達(dá)185～200)，且無致畸、致癌、致突變作用，具有良好的應(yīng)用前景，可能成為一種新型抗球蟲藥物。依據(jù)《中華人民共和國獸藥典》規(guī)定，殘留溶劑檢測須對(duì)合成工藝中使用的全部第二類溶劑和終產(chǎn)品精制過程中使用的第三類溶劑進(jìn)行研究。在合成沙咪珠利的工藝中，使用了第二類溶劑甲醇和甲苯;精制時(shí)使用了第三類溶劑乙醇，因此本文建立了這三種有機(jī)溶劑的氣相色譜法檢測其殘留含量［4－5］。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑 Agilent 7890A氣相色譜儀，帶FID檢測器(美國Agilent公司);DB－WAX(30 m×0.25 mm × 0.25 μm)色譜柱(美國 Agilent公司);Mettler Toledo XP504分析天平(梅特勒－托利多公司);甲醇、乙醇、甲苯、二氧六環(huán)和N，N－二甲基甲酰胺均為分析純。

1.2 標(biāo)準(zhǔn)品和樣品 沙咪珠利對(duì)照品(批號(hào):20130429)及原料藥(批號(hào):20130304、20130308、20130411)為本實(shí)驗(yàn)室合成。

1.3 溶液配制

1.3.1 內(nèi)標(biāo)溶液 精密稱量154.9 mg二氧六環(huán)，置于50 mL容量瓶中，加N，N－二甲基甲酰胺定容至刻度，搖勻，即得。

1.3.2 供試品溶液 精密稱取沙咪珠利原料藥0.1 g，加入1 mL內(nèi)標(biāo)溶液，置于10 mL容量瓶中，加N，N－二甲基甲酰胺定容至刻度，搖勻，即得。

1.3.3 對(duì)照品溶液 精密稱量31.68 mg甲醇，47.4 mg乙醇，8.67 mg甲苯，置于50 mL 容量瓶中，加N，N－二甲基甲酰胺定容至刻度，搖勻;精密量取該溶液5 mL，置于10 mL容量瓶中，加1 mL內(nèi)標(biāo)溶液，加N，N－二甲基甲酰胺定容至刻度，搖勻，即得對(duì)照品溶液。其中甲醇、乙醇和甲苯的含量分別為 316.8、474 和 86.7 μg/mL。

1.4 檢測方法

1.4.1 色譜條件 DB－WAX(30 m ×0.25 mm×0.25 μm)色譜柱;進(jìn)樣口溫度180℃，分流比50:1;程序升溫，初始柱溫60℃，保持4 min，50℃/min升至80℃，保持1 min，再以100℃/min升至200℃，保持4 min;載氣為氮?dú)?，柱流?.0 mL/min;檢測器為FID，檢測器溫度200℃，氫氣流速30 mL/min，空氣流速 300 mL/min;進(jìn)樣量 1.0 μL。

1.4.2 測定方法 精密量取供試品溶液1.0 μL，按照上述氣相色譜法采用溶液直接進(jìn)樣，記錄色譜圖，計(jì)算各待測物與內(nèi)標(biāo)物的峰面積比，以標(biāo)準(zhǔn)曲線定量測定。甲醇含量不得超過0.3%，乙醇的含量不得超過 0.5%，甲苯的含量不得超過0.089%［5］。

1.5 方法學(xué)驗(yàn)證

1.5.1 系統(tǒng)適用性試驗(yàn) 根據(jù)《中華人民共和國獸藥典》殘留溶劑測定要求，進(jìn)行系統(tǒng)適用性試驗(yàn)［5］。取 N，N －二甲基甲酰胺溶劑進(jìn)樣 1.0 μL，記錄色譜圖(圖1)，由圖1可見，空白溶劑在各待測物的出峰處沒有干擾;取對(duì)照品溶液，按照1.4.2項(xiàng)中測定方法連續(xù)進(jìn)樣5次，記錄色譜圖(圖2)。以各待測物與內(nèi)標(biāo)物的色譜峰計(jì)算，試驗(yàn)所用毛細(xì)管色譜柱理論塔板數(shù)大于5000;色譜圖中，各待測物與相鄰色譜峰分離度大于1.5;對(duì)照品溶液連續(xù)進(jìn)樣5次，所得各待測物與內(nèi)標(biāo)物峰面積之比的RSD值均小于5%，系統(tǒng)適用性試驗(yàn)結(jié)果見表1和表2。

圖1 溶劑N，N-二甲基甲酰胺的色譜圖

圖2 甲醇、乙醇、甲苯和二氧六環(huán)(內(nèi)標(biāo))的色譜圖

表1 系統(tǒng)適用性結(jié)果

表2 進(jìn)樣重現(xiàn)性結(jié)果

1.5.2 精密度

1.5.2.1 重復(fù)性 取對(duì)照品溶液，按照 1.4.2 項(xiàng)中色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6針，記錄色譜圖，以內(nèi)標(biāo)法計(jì)算各待測物的含量，計(jì)算RSD值，結(jié)果顯示均小于2%(表3)。

表3 重復(fù)性測定結(jié)果

1.5.2.2 日間精密度 取對(duì)照品溶液，按照 1.4.2項(xiàng)中色譜條件，分別由不同的三人于第1、2、3天分別進(jìn)樣，記錄色譜圖，以內(nèi)標(biāo)法計(jì)算各待測物的RSD值，結(jié)果顯示均小于5%(表4)。

表4 日間精密度試驗(yàn)結(jié)果

1.5.3 線性范圍 精密取甲醇、乙醇和甲苯適量，置于10 mL容量瓶中加1 mL內(nèi)標(biāo)溶液，加N，N－二甲基甲酰胺定容至刻度，搖勻，分別配制成一系列不同質(zhì)量濃度的甲醇、乙醇、甲苯和內(nèi)標(biāo)的混合溶液，按照1.4.2項(xiàng)中色譜條件進(jìn)樣，記錄色譜圖。以各待測物濃度(μg/mL)為橫坐標(biāo)，以各待測物與內(nèi)標(biāo)物的峰面積比為縱坐標(biāo)，建立回歸方程，甲醇、乙醇和甲苯的回歸方程分別如表5所示。結(jié)果顯示，各待測物R2＞0.99，線性關(guān)系良好。

表5 線性及范圍結(jié)果

1.5.4 檢測限及定量限 取各待測物線性最低濃度溶液，逐級(jí)稀釋，按照1.4.2項(xiàng)中色譜方法進(jìn)樣。當(dāng)信噪比為3時(shí)，將該待測物在沙咪珠利樣品濃度記為檢測限;同理，信噪比為10時(shí)，記為定量限。各待測物測定結(jié)果如表6所示。

表6 檢測限與定量限結(jié)果

1.5.5 回收率 對(duì)沙咪珠利樣品殘留溶劑水平進(jìn)行初步測定，測得乙醇濃度約為25 μg/kg。精密量取 31.68 mg甲醇、47.4 mg 乙醇、8.67 mg 甲苯，置于100 mL容量瓶中，加N，N－二甲基甲酰胺定容至刻度，搖勻;精密量取該溶液 0.4、0.5、0.6 mL 各3份，分別置于9個(gè)10 mL容量瓶中，各加1 mL內(nèi)標(biāo)溶液;取9份沙咪珠利原料藥(批號(hào):20130308)0.1 g，精確稱重，分別置于上述9個(gè)10 mL容量瓶，加N，N－二甲基甲酰胺定容至刻度，搖勻，即得。此時(shí)乙醇濃度分別為 18.96、23.7、28.44 μg/kg。選取乙醇濃度23.7 μg/kg作為回收率100%標(biāo)準(zhǔn)，按照1.4.2項(xiàng)中色譜方法進(jìn)樣。結(jié)果顯示，各次測定回收率均為95% ～105%，且RSD＜5%。甲醇、乙醇、甲苯的回收率測定結(jié)果分別見表7、表8、表9。

表7 甲醇回收率測定結(jié)果

表8 乙醇回收率測定結(jié)果

表9 甲苯回收率測定結(jié)果

2 樣品殘留溶劑檢測結(jié)果

取20130304、20130308、20130411 批次沙咪珠利原料藥，按照1.3.3項(xiàng)中方法配制供試品溶液，按照1.4.2項(xiàng)中色譜條件進(jìn)樣，記錄色譜圖。經(jīng)測定，各批次沙咪珠利樣品中均未檢出甲醇和甲苯，檢出乙醇(圖3)。沙咪珠利樣品中乙醇測定結(jié)果如表10所示。

表10 乙醇?xì)埩羧軇z測結(jié)果

圖3 沙咪珠利樣品的色譜圖

3 討論

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，沙咪珠利樣品中未檢出甲醇和甲苯，檢出乙醇?xì)埩?，其中?.1 g沙咪珠利樣品中含有乙醇濃度為 18.41 ～ 22.34 μg/mL，在樣品中占百分比為0.184% ～0.223%，低于藥典規(guī)定限度0.5%［5］。因此沙咪珠利原料藥中的溶劑殘留符合獸藥典規(guī)定。

在選擇色譜條件時(shí)，曾選用過弱極性的HP－5和DB－35ms毛細(xì)管柱。但由于甲醇和乙醇極性相近，二者在HP－5和DB－35ms色譜柱上無法實(shí)現(xiàn)基線分離，而使用極性較強(qiáng)的DB－WAX色譜柱后，可以滿足色譜分離度要求。

由于研究中采用N，N－二甲基甲酰胺作為溶劑，其沸點(diǎn)較高，為152.8℃，因此進(jìn)樣口溫度設(shè)定為180℃，目的在于使高沸點(diǎn)的N，N－二甲基甲酰胺溶劑能夠在進(jìn)樣口瞬間全部蒸發(fā);采用程序升溫使得色譜柱在短時(shí)間內(nèi)迅速升溫至200℃，目的在于使N，N－二甲基甲酰胺的出峰時(shí)間提前，縮短分析時(shí)間。

本研究建立了測定沙咪珠利中甲醇、乙醇和甲苯溶劑殘留的氣相色譜方法。研究表明，本方法簡單、精密度高、重現(xiàn)性好及檢測限低。采用本方法能夠很好的評(píng)價(jià)沙咪珠利合成工藝的殘留溶劑水平。

［1］ 索 勛，李國清.雞球蟲病學(xué)［M］.北京:中國農(nóng)業(yè)大學(xué)出版社，1998:166－167.

［2］ 韓春來，王麗明，鄭明學(xué)，等.雞球蟲的耐藥性研究進(jìn)展［J］.畜禽業(yè)，2001，(4):32 －33.

［3］ 李佩國.河北省雞柔嫩艾美耳球蟲地方株的耐藥性檢測［D］.長春:吉林大學(xué)，2010.

［4］ 胡昌勤，劉 穎.藥物殘留溶劑的監(jiān)控及其分析方法［J］.藥學(xué)學(xué)報(bào)，2007，42(12):1237－1242.

［5］ 中國獸藥典委員會(huì).中華人民共和國獸藥典二○一○年版一部(附錄81)［S］.