劉 潔，牟林琳，何文輝，李晶梅，謝紅玲，廖園園，朱 薇，漆世華，溫文生

(武漢中博生物股份有限公司，武漢430070)

犬細小病是由犬細小病毒(CPV)引起的一種急性、以出血性腸炎或非化膿性心肌炎為主要特征的犬科和鼬科動物的重要傳染?。?］。我國已建立的用于檢測CPV抗體的血清學方法有血凝試驗、血凝抑制試驗、瓊脂擴散試驗等，但是由于CPV與貓泛白細胞減少癥病毒、水貂腸炎病毒三者之間能發(fā)生交叉血清學反應，因此在實際應用中這些方法常受到限制。酶聯免疫吸附試驗(ELISA)可檢測CPV抗原，也可檢測CPV抗體;PCR檢測敏感性高，特異性強，可分辨野毒感染和疫苗免疫，但這兩種技術都需要特殊的儀器設備。利用膠體金標記單克隆CPV表面抗體，制成檢測CPV抗原的膠體金檢測試紙條敏感性高，特異性強，穩(wěn)定性好，操作簡便快速，結果易于分析判定［2］。

本研究利用膠體金免疫層析技術，成功研制出犬細小病毒膠體金免疫層析快速檢測試紙條，對CPV抗原的快速檢測對防控該病及流行病學調查有較大的輔助作用。

1 材料與方法

1.1 材料 氯金酸購自天津光復精細化工研究所;檸檬酸三鈉購自AMRESCO;抗犬細小病毒單抗(CPV－F1和CPV－B6)由武漢中博生物股份有限公司制備保存［3］;羊抗小鼠IgG二抗購自博士德公司;樣品墊、金標墊、NC膜購自上海捷寧生物科技有限公司;犬細小病毒(CPV)，VR－2209和犬瘟熱病毒(CDV)，VR－1587購自ATCC;犬用狂犬病毒滅活苗購自英特威;5份犬細小病毒抗原樣品(血凝試驗檢測陽性)、10份健康犬糞便樣品(血凝試驗檢測陰性)均采自寵康動物診所接診寵物狗，60份與進口商品化犬細小病毒抗原檢測試紙對比樣品由寵康動物診所提供;韓國進口試紙條購自韓國安捷，貨號RG11－01。

1.2 方法

1.2.1 犬細小病毒抗原檢測試紙條的制備［4］

1.2.1.1 膠體金的制備 采用檸檬酸三鈉還原法［4］制備粒徑為25 nm的膠體金溶液。

1.2.1.2 膠體金的標記 量取膠體金溶液20 mL，調pH值至9.0，攪拌加入抗犬細小病毒單克隆抗體CPV－F1 0.08 mg攪拌30 min，再加入終濃度20%的PEG－20000穩(wěn)定未結合的膠體金顆粒，8700 r/min離心30 min，棄上清，再用金標緩沖溶液定容至2 mL，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.1.3 金標墊的制備 標記好的膠體金溶液均勻涂布于金標墊上，37℃烘干2 h備用。

1.2.1.4 質控線和檢測線的包被 將羊抗小鼠IgG二抗和抗犬細小病毒單克隆抗體CPV－B6分別包被于硝酸纖維素膜作為質控線和檢測線，37℃烘干2 h備用。

1.2.1.5 犬細小病毒抗原檢測試紙的制備 將制備好的硝酸纖維素膜、金標墊、樣品墊和吸水紙依次粘貼于背襯板上，切條機切割成4 mm條，裝入卡殼，封裝于裝有干燥劑的鋁箔袋中。2～28℃保存?zhèn)溆茫?］。

1.2.2 樣品檢測和判定標準［6］將沾有犬糞便的取樣棉簽插入稀釋液中攪拌均勻，靜置片刻取上清液(80～120 μL，滴管 3～4滴)緩慢滴加到加樣孔中，將試紙卡平放，10 min觀察結果。判定標準如圖1:若在試紙條上出現兩條紅色的條帶(檢測線和質控線)，則為陽性結果。若在試紙條上只在質控線處出現一條紅色的條帶則為陰性結果。若質控線處不出現紅色的條帶則試紙失效。

1.2.3 陽性參考樣品的制備［3］犬細小病毒(VR－2209)接種到已長成單層的 F81細胞上，37℃培養(yǎng)72 h后，收取培養(yǎng)液。加入1%硫柳汞，使其終濃度為0.01%，加入二乙烯亞胺(BEI)使其終濃度為5 mmol/L，37℃滅活16 h，加入終濃度5 mmol/LNa2S2O3中和 BEI，10000 r/min 2 ～8 ℃離心30 min，去除細胞碎片，取上清液。將上述上清液分裝1 mL/支，－70℃保存?zhèn)溆谩?/p>

圖1 犬細小病毒抗原檢測膠體金試紙條結果判定示意圖

1.2.4 試紙條質量的評估［7］

1.2.4.1 特異性 用制備好的犬細小病毒抗原檢測試紙條檢測5份犬細小病毒抗原樣品、10份健康犬糞便樣品、犬瘟熱病毒樣品1份、狂犬病毒滅活疫苗樣品1份。觀察檢測結果。

1.2.4.2 敏感性 將犬細小病毒陽性參考樣品做22～215倍比稀釋，用制備好的犬細小病毒抗原檢測試紙條進行檢測，同時將同一陽性參考樣品做21～212倍比稀釋，做病毒血凝試驗(HA)［8］作為對照，評價試紙條的敏感性。

1.2.4.3 與進口商品化犬細小病毒抗原檢測試紙的符合率 對60份待檢樣品分別用制備的犬細小病毒抗原檢測試紙條與韓國進口犬細小病毒檢測試紙條同時進行檢測。

2 結果

2.1 特異性試驗 結果見圖2。犬細小病毒檢測試紙條檢測5份犬細小病毒陽性糞便樣品均為陽性，檢測10份健康犬糞便樣品均為陰性，同時不與犬瘟熱病毒和狂犬病毒發(fā)生交叉反應，說明有較好的特異性。

圖2 特異性檢測結果

2.2 敏感性試驗 本研究試紙條檢測陽性參考樣品最低稀釋度為211(圖3)，而血凝試驗檢測到陽性參考樣品的血凝價為210(圖4)，兩種檢測結果表明犬細小病毒檢測試紙條比血凝試驗敏感性高一倍。

2.3 符合率試驗 同時用本研究制備的犬細小病毒抗原檢測試紙條和韓國進口的犬細小病毒檢測試紙條對60份待檢樣品中的犬細小病毒進行檢測，結果(表1)表明，兩試紙條對待檢樣品的陽性符合率為100%，陰性符合率為97.5%，總符合率為98%。

圖3 試紙條敏感性試驗結果

圖4 間接血凝試驗結果

表1 兩種試紙條檢測樣品對比結果

3 討論

本研究制備的試紙條與HA檢測同一陽性樣品，檢測結果比HA高一倍，且操作簡單、快速;與韓國進口的試紙條進行符合率檢驗，結果表明陽性符合率為100%，陰性符合率為97.5%，有一個陰性不符合的結果，但經PCR檢測，該樣品的檢測結果為陽性，推測該樣品含有的病毒量較低。

犬細小病毒病是犬常見疾病，快速、準確的診斷該病為治療該病提供有利的參考依據。膠體金免疫層析試紙條是目前確診該病的主要診斷方法，一般寵物醫(yī)院都會選用進口產品。本研究制備的犬細小病毒抗原膠體金檢測試紙條具有敏感性高、特異性好等特點，對比進口產品符合率也較高，可替代進口產品使用，降低診斷成本，也可用于流行病學調查，為消除該疾病提供有效的輔助手段。

［1］ 殷 震，劉景華.動物病毒學［M］.第2版，北京:科學出版社，1997:736－750.

［2］ Pratelli A，Cavalli A，Martella V，et al.Canine parvovirus(CPV)vaccination:comparison of neutralizing antibody responses in pups after inoculation with CPV2 or CPV2b modified live virus vaccine［J］.Virology，2001，8(4):612 －615.

［3］ 劉 潔，何文輝，李晶梅，等.分泌抗犬細小病毒單克隆抗體雜交瘤細胞株的建立［J］.中國獸藥雜志，2013，47(7):9－12.

［4］ 劉文俊，王仲兵，鄭明學，等.免疫層析快速診斷試紙條的制備及在動物疾病診斷中的應用［J］.畜牧獸醫(yī)科技信息，2009，11:8－10.

［5］ 劉 潔，夏興霞，王永山，等.大腸桿菌O157:H7抗體膠體金免疫層析檢測試紙條的研制［J］.中國預防獸醫(yī)學報，2010，32(5):375－378.

［6］ 劉宏偉，邱旭方，王俊朝，等.犬細小病毒膠體金免疫層析快速診斷試紙條的研制［J］.中國養(yǎng)犬雜志，2002，2(13):18－20.

［7］ 孫 洋，馮書章，郭學軍，等.腸出血性大腸桿菌O157膠體金免疫層析試紙條的研制［J］.中國人獸共患病學報，2008，24(4):356－359.

［8］ 秦海斌，張匯東，繆 勤，等.犬細小病毒血凝的檢測和血凝抑制試驗方法的優(yōu)化［J］.中國比較醫(yī)學雜志，2009，19(7):49－52.