李雪婷，謝勇恩

(川北醫(yī)學(xué)院 免疫與分子生物學(xué)研究所， 四川 南充 637007)

MBP-1過表達(dá)對食管癌Eca-109細(xì)胞增殖和凋亡的影響

李雪婷，謝勇恩*

(川北醫(yī)學(xué)院 免疫與分子生物學(xué)研究所， 四川 南充 637007)

MBP-1又稱為c-MYC啟動子結(jié)合蛋白(c-MYC promoter binding protein)，其過表達(dá)可抑制多種癌細(xì)胞的增殖，但對食管癌細(xì)胞的影響尚未見報道。本研究構(gòu)建了MBP-1的重組真核表達(dá)質(zhì)粒，并將該重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染食管癌Eca-109細(xì)胞，檢測MBP-1能否在食管癌細(xì)胞中過表達(dá)及其對食管癌細(xì)胞增殖和凋亡的影響。

1 材料與方法

1.1 質(zhì)粒載體和細(xì)胞系:pcDNA3.1(+)質(zhì)粒(本研究所唐恩潔教授贈送)，含MBP-1基因的質(zhì)粒pCMV6-MBP-1(Origene公司)，食管癌Eca-109細(xì)胞系(中國科學(xué)院上海細(xì)胞生物研究所)。

1.2 主要試劑:PCR試劑盒(成都朝暉生物技術(shù)公司)。Lipofectamine2000、DAB 顯色試劑盒、MTT、鼠抗MBP-1單克隆抗體、兔抗β-actin單克隆抗體、辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗鼠IgG和辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔IgG(晶美公司)，凋亡檢測試劑YO-PRO-1(Molecular Probe公司)。其余試劑均為國產(chǎn)或進(jìn)口分裝(分析純)。

1.3 MBP-1重組真核表達(dá)載體的構(gòu)建:根據(jù)GenBank中MBP-1的mRNA序列(GenBank accession number：GU170215)，設(shè)計如下引物：P1:5′-GCAAGCTTATGGATGGAACAGAAAATAAAT CTAAG-3′；P2:5′-GCGGATCCACAGCTTACTTGGCCAG-3′。引物P1的5′末端引入HindⅢ的酶切位點(diǎn)，引物P2的5′末端引入BamHⅠ酶切位點(diǎn)。以質(zhì)粒pCMV6-MBP-1為模板，通過PCR擴(kuò)增獲取MBP-1目的基因，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物與質(zhì)粒pcDNA3.1(+)的酶切、連接、轉(zhuǎn)化和重組質(zhì)粒的篩選參照文獻(xiàn)[1]進(jìn)行，對重組質(zhì)粒進(jìn)行酶切和DNA測序鑒定。

1.4 Western blot檢測:食管癌Eca-109細(xì)胞以2×106個細(xì)胞/孔接種25 cm2細(xì)胞培養(yǎng)瓶，置CO2孵箱培養(yǎng)，當(dāng)細(xì)胞達(dá)90%匯合時用于轉(zhuǎn)染，細(xì)胞分為3組，每組3瓶細(xì)胞，第1組轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒，第2組轉(zhuǎn)染質(zhì)粒pcDNA3.1(+)，第3組不做任何處理，細(xì)胞轉(zhuǎn)染按脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑Lipofectin2000說明書進(jìn)行。轉(zhuǎn)染72 h后收集細(xì)胞，細(xì)胞總蛋白的制備及免疫印跡檢測參照文獻(xiàn)[2]進(jìn)行，通過圖像分析軟件對蛋白印跡條帶進(jìn)行吸光度分析，計算MBP-1印跡條帶與β-actin印跡條帶的吸光度值之比作為MBP-1的表達(dá)量，本實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.5 細(xì)胞增殖檢測:采用MTT法，Eca-109細(xì)胞以5×103個/孔接種96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，置CO2孵箱培養(yǎng)，當(dāng)細(xì)胞匯合至70%后進(jìn)行轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染前將細(xì)胞分成4組，第1組細(xì)胞用重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染，第2組細(xì)胞用空白質(zhì)粒pcDNA3.1(+)轉(zhuǎn)染，第3組細(xì)胞只加入轉(zhuǎn)染劑量的脂質(zhì)體，第4組細(xì)胞不做任何處理作為空白對照，各組均設(shè)3個重復(fù)孔，于轉(zhuǎn)染后72 h向各孔細(xì)胞中加入MTT(50 g/L)20 μL，細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)4 h后，將細(xì)胞培養(yǎng)板放入離心機(jī)中以2 000r/min離心10 min，去除細(xì)胞培養(yǎng)液，每孔加入100 μL二甲基亞砜充分振蕩混勻，于酶標(biāo)儀上測定其490 nm處的A值，計算細(xì)胞增殖抑制率[細(xì)胞增殖抑制率=(1-實(shí)驗(yàn)孔A值/空白對照空A值) ×100%]，該實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.6 細(xì)胞凋亡檢測:Eca-109細(xì)胞以2×104個/孔接種24孔板，共接種9孔，當(dāng)細(xì)胞生長達(dá)70%匯合后進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染前將細(xì)胞分成3組，每組3孔細(xì)胞，第1組加入轉(zhuǎn)染劑量的脂質(zhì)體，第2組用空白質(zhì)粒pcDNA3.1(+)進(jìn)行轉(zhuǎn)染，第3組細(xì)胞用重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染72 h后進(jìn)行細(xì)胞凋亡檢測，向每孔細(xì)胞中加入凋亡檢測試劑YO-PRO-1 至終濃度為0.1 μmol/L，同時加入碘化丙啶(PI)至終濃度為2 mg/L，30 min后，用倒置熒光顯微鏡觀察，計數(shù)每200個細(xì)胞中凋亡細(xì)胞所占的百分比，該實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.7 統(tǒng)計學(xué)分析:使用SPSS13.0統(tǒng)計分析軟件，采用方差分析法比較各組細(xì)胞相應(yīng)檢測指標(biāo)的差異(Plt;0.05)。

2 結(jié)果

2.1 MBP-1重組真核表達(dá)載體的構(gòu)建:PCR擴(kuò)增獲得了大小約1 kb的DNA片段，將其定向克隆入質(zhì)粒載體pcDNA3.1(+)后，篩選到分子質(zhì)量約為6.4 kb的重組質(zhì)粒，DNA測序結(jié)果表明插入片段的核苷酸序列與GenBank中MBP-1的mRNA序列符合率為100%，表明重組質(zhì)粒構(gòu)建成功，將其命名為pcDNA3.1(+)/MBP-1。

2.2 Western blot檢測結(jié)果:免疫印跡雜交檢測結(jié)果(圖1)，其中質(zhì)粒pcDNA3.1(+)轉(zhuǎn)染細(xì)胞和空白對照細(xì)胞MBP-1的表達(dá)量分別為0.302±0.059和0.334±0.067，二者表達(dá)量無明顯差異。重組質(zhì)粒pcDNA3.1(+)/MBP-1轉(zhuǎn)染細(xì)胞MBP-1的表達(dá)量為0.626±0.073，其表達(dá)量顯著高于質(zhì)粒pcDNA3.1(+)轉(zhuǎn)染細(xì)胞和空白對照細(xì)胞(Plt;0.05)。

1.untreated Eca-109 cells；2.pcDNA3.1(+) transfected Eca-109 cells；3.pcDNA3.1(+)/MBP-1 transfected Eca-109 cells圖1 Western-blot檢測MBP-1在食管癌細(xì)胞Eca-109中的表達(dá)Fig 1 Western-blot analysis of MBP-1 expression in esophageal cancer cell Eca-109

2.3 細(xì)胞增殖檢測結(jié)果:轉(zhuǎn)染劑量的脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染細(xì)胞和空白質(zhì)粒轉(zhuǎn)染食管癌細(xì)胞的細(xì)胞增殖抑制率分別為7.38%±0.81%和9.37%±1.02%，二者間無顯著性差異, 而重組質(zhì)粒pcDNA3.1(+)/MBP-1轉(zhuǎn)染細(xì)胞的細(xì)胞增殖抑制率為30.03%±4.1%，顯著高于脂質(zhì)體和空白質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞(Plt;0.05)。

2.4 細(xì)胞凋亡檢測結(jié)果：熒光顯微鏡鏡檢結(jié)果(圖2)，其中呈現(xiàn)亮綠色熒光的為凋亡細(xì)胞。轉(zhuǎn)染劑量的脂質(zhì)體處理細(xì)胞和空白質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞在轉(zhuǎn)染后72 h的細(xì)胞凋亡率分別為7.97%±1.71% 和8.38%±3.34%，二者之間無顯著性差異, 而重組質(zhì)粒pcDNA3.1(+)/MBP-1轉(zhuǎn)染細(xì)胞在轉(zhuǎn)染后72 h的細(xì)胞凋亡率為26.49%±2.82%，明顯高于脂質(zhì)體和空白質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞(Plt;0.05)。

3 討論

本研究通過構(gòu)建MBP-1重組真核表達(dá)質(zhì)粒，人為造成MBP-1在食管癌細(xì)胞過表達(dá)的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步研究了MBP-1過量表達(dá)對食管癌細(xì)胞增殖及凋亡的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)MBP-1過量表達(dá)可顯著抑制食管癌細(xì)胞的增殖并促進(jìn)食管癌細(xì)胞的凋亡。MBP-1的類似作用也在其他腫瘤細(xì)胞的研究中得到證實(shí)，研究發(fā)現(xiàn)體外培養(yǎng)的胃癌細(xì)胞轉(zhuǎn)染MBP-1真核表達(dá)質(zhì)粒pcDNA-HA-MBP-1后，可使MBP-1過表達(dá)，過表達(dá)MBP-1的胃癌細(xì)胞其增殖活性明顯減弱，癌細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移活性也明顯受到抑制，而用siRNA沉默胃癌細(xì)胞MBP-1表達(dá)則使癌細(xì)胞的增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移活性增強(qiáng)。隨后的動物實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)MBP-1在胃癌細(xì)胞的過表達(dá)可使其在裸鼠體內(nèi)的成瘤活性降低[3]。本研究沒有采用流式術(shù)檢測細(xì)胞凋亡， 因?yàn)橘N壁細(xì)胞必須用胰蛋白酶消化收集后，才能進(jìn)行流式細(xì)胞學(xué)檢測，在消化過程中可能導(dǎo)致細(xì)胞的損傷和破壞，導(dǎo)致檢測結(jié)果假陽性高、結(jié)果重復(fù)性差等缺點(diǎn)。YO-PRO-1是美國Molecular Probe公司專門為檢測貼壁細(xì)胞凋亡而開發(fā)的一種DNA特異性熒光染料, 在細(xì)胞凋亡的早期, 細(xì)胞膜發(fā)生輕微通透性改變時，YO-PRO-1能夠進(jìn)入細(xì)胞，并與核內(nèi)DNA結(jié)合發(fā)出強(qiáng)烈的綠色熒光，而PI只能透過壞死細(xì)胞通透性很強(qiáng)的細(xì)胞膜而與DNA結(jié)合發(fā)出紅色熒光，二者聯(lián)合使用，可將活細(xì)胞、凋亡細(xì)胞和壞死細(xì)胞區(qū)分開來，這種方法操作簡便，其結(jié)果也更加可靠。

A.llipofectin treated cells under the ordinary light；B.llipofectin treated cells under the fluorescent light；C.pcDNA3.1(+) transfected cells under the ordinary light；D.pcDNA3.1(+) transfected cells under the fluorescent light；E.pcDNA3.1(+)/MBP-1 transfected cells under the ordinary light；F.pcDNA3.1(+)/MBP-1 transfected cells under the fluorescent light

圖2倒置熒光顯微鏡下細(xì)胞凋亡結(jié)果
Fig2Cellapoptosisunderinvertedfluorescentmicroscope(×100)

[1] 盧俊宇，金鵬，高巍, 等. 錯配修復(fù)基因hMLH1啟動子螢光素酶報告基因載體的構(gòu)建及鑒定[J]. 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與臨床，2012，32：338-341.

[2] 何昀，劉東堯，溫晟，等. 小干擾RNA抑制L2RYC細(xì)胞MDR1表達(dá)及逆轉(zhuǎn)對長春新堿的耐藥性[J]. 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與臨床，2012，32：1009-1014.

[3] Hsu WK, Hsieh RH, Wu CW,etal. MBP-1 Suppresses growth and metastasis of gastric cancer cells through COX-2[J]. Mol Biol Cell, 2009, 20：5127-5137.

新聞點(diǎn)擊

上胃腸道癌癥患者的預(yù)防性抗凝血劑

據(jù)美國WebMD醫(yī)學(xué)新聞網(wǎng)(2012-07-12)報道，雖然癌癥本身增加了靜脈栓塞(VTE)風(fēng)險，化療更進(jìn)一步升高風(fēng)險，專家們的共識是，證據(jù)還不足以建議對所有患者使用預(yù)防性抗凝血劑，是針對于某些特定類型癌癥患者使用。

在第14屆世界胃腸道癌癥研討會中，英國的兩組研究者提出了上胃腸道(UGI)惡性腫瘤患者的這一特殊案例。

英國Hull amp; East Yorkshire NHS Trust腫瘤部的Rajarshi Roy醫(yī)生認(rèn)為，基于對胰臟癌患者的初期試驗(yàn)結(jié)果，使用dalteparin作為預(yù)防性抗凝血劑顯著降低了以gemcitabine治療的胰臟癌患者的所有VTE風(fēng)險(European Journal of Cancer.2012；48；1283-1292)。

基于這項研究結(jié)果，Roy醫(yī)生等人使用預(yù)防性dalteparin治療他們的胰臟癌患者，這類患者一直都是血栓的高風(fēng)險人群?，F(xiàn)在，他們提出將它擴(kuò)展到其他有VTE高風(fēng)險的UGI惡性腫瘤患者。

果蠅基因研究可能發(fā)現(xiàn)為何女性比男性活得更久

據(jù)美國國家科學(xué)院學(xué)報(PNAS)網(wǎng)站(2012-08-09)報道，近日一項澳大利亞與英國的共同研究指出，雄性果蠅的粒線體DNA突變會影響老化死亡的速度，這將可提供線索解釋為何在動物界雌性多半比雄性長壽。

研究團(tuán)隊使用果蠅進(jìn)行基因與老化的研究，主要由于果蠅的生命進(jìn)程與其他動物類似，也包括人類在內(nèi)，而果蠅的生命周期約1個月，若要研究世代影響所需花費(fèi)的時間不長。

研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，粒線體DNA突變使雄性老化，同樣的突變對雌性老化卻沒有影響，且粒線體DNA是通過卵子傳給后代，導(dǎo)致自然選擇的過程也無法篩選出那些不利于雄性的粒線體DNA突變，代代遺傳后這些只傷害雄性的突變便會持續(xù)累積。而且突變并不只存在于一處，而是散布在粒線體基因組的各處。

主要作者Damian Dowling研究員認(rèn)為，這項研究也發(fā)現(xiàn)粒線體DNA突變與雄性不孕之間的關(guān)聯(lián)性，顯示在基因突變對男性健康的影響上，粒線體扮演重要角色。研究現(xiàn)階段的任務(wù)將進(jìn)一步了解雄性是否有哪些基因機(jī)制能產(chǎn)生自我保護(hù)，以抵抗這些具有傷害性的基因突變。

該研究刊登于當(dāng)代生物學(xué)(Current Biology)期刊。

2013-01-03

2013-05-02

四川省杰出青年科學(xué)基金(08ZQ026-081)

*通信作者(correspondingauthor)： cbyxye0369@163.com

1001-6325(2014)02-0246-03

R 735.1

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