羅艷紅，鄧益斌，鄒佳峻

(右江民族醫(yī)學(xué)院 臨床學(xué)院 醫(yī)學(xué)檢驗中心, 廣西 百色 533000)

研究論文

反基因鎖核酸體外阻斷肝癌細(xì)胞系乙肝病毒S基因表達(dá)

羅艷紅，鄧益斌*，鄒佳峻

(右江民族醫(yī)學(xué)院 臨床學(xué)院 醫(yī)學(xué)檢驗中心, 廣西 百色 533000)

目的探討針對乙肝病毒S基因同聚嘌呤區(qū)的鎖核酸體外抑制細(xì)胞內(nèi)病毒復(fù)制的效果。方法針對乙肝病毒S基因同聚嘌呤區(qū)設(shè)計合成鎖核酸、硫代寡核苷酸、未修飾寡核苷酸及無關(guān)對照序列，以陽離子脂質(zhì)體介導(dǎo)，體外轉(zhuǎn)染HepG2.2.15細(xì)胞，采用熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)技術(shù)和時間分辨免疫熒光技術(shù)分別監(jiān)測2、4、6、8和10 d細(xì)胞培養(yǎng)上清液中HBV DNA、HBsAg和HBeAg的含量;四甲基偶氮唑藍(lán)法檢測鎖核酸對細(xì)胞代謝的影響。結(jié)果加入鎖核酸后，對細(xì)胞內(nèi)HBV DNA復(fù)制、HBsAg與HBeAg表達(dá)均有較明顯的時間和劑量依賴性抑制作用，6 d后抑制率分別為52.14%、57.48%和29.63%。鎖核酸對細(xì)胞代謝無明顯影響。結(jié)論針對乙肝病毒S基因同聚嘌呤區(qū)的鎖核酸，體外能有效抑制乙肝病毒的復(fù)制，既為乙肝病毒治療提供有效靶位，也為反基因治療提供理論和實(shí)驗依據(jù)。

脂質(zhì)體; 乙型肝炎病毒; 鎖核酸; 反基因治療

反基因治療(anti-gene therapy)是由特定寡聚脫氧核苷酸與靶雙鏈DNA同聚嘧啶或同聚嘌呤區(qū)專一性結(jié)合形成局部三螺旋結(jié)構(gòu)，阻止靶DNA與聚合酶、轉(zhuǎn)錄因子等蛋白結(jié)合，實(shí)現(xiàn)抑制靶基因的復(fù)制與表達(dá)的目的。鎖核酸(locked nucleic acid，LNA)是新發(fā)現(xiàn)的一種帶環(huán)狀結(jié)構(gòu)的核苷酸衍生物[1-4]，與其他寡核苷酸相比，具有更高的熱穩(wěn)定性、更好的分子雜交能力、更強(qiáng)的抗核酸酶降解能力、更好的脂溶性和更低的細(xì)胞毒性等優(yōu)勢。前期研究結(jié)果表明，針對HBVS基因mRNA單鏈的反義鎖核酸[5]和HBVpreS1[6]基因dsDNA的反基因鎖核酸均能有效抑制細(xì)胞內(nèi)乙肝病毒的復(fù)制。為了進(jìn)一步觀察鎖核酸對細(xì)胞內(nèi)HBV復(fù)制的抑制效果，本研究針對乙肝病毒最保守的S基因區(qū)設(shè)計合成反基因鎖核酸片段，以陽離子脂質(zhì)體介導(dǎo)，體外轉(zhuǎn)染HepG2.2.15細(xì)胞系，并觀察其抗病毒效果，旨在尋找新型、專一及有效的抗乙肝病毒藥物。

1 材料與方法

1.1 材料

HepG2.2.15細(xì)胞為HBV DNA(ayr亞型)全基因轉(zhuǎn)染肝癌細(xì)胞系(中國典型培養(yǎng)物保藏中心)， 能穩(wěn)定分泌乙型肝炎病毒顆粒、乙型肝炎病毒表面抗原(HBsAg)和乙型肝炎病毒e抗原(HBeAg)，右江民族醫(yī)學(xué)院臨床學(xué)院醫(yī)學(xué)檢驗中心常規(guī)培養(yǎng)于含G418 (380ITI1)、10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中，37 ℃、5% CO2條件下每5～6天傳代1次。 DMEM培養(yǎng)基和G418(Gibco公司)。 胎牛血清(杭州四季清公司)。Lipofectamine2000(Invitrogen公司)。HBV DNA定量檢測試劑盒(深圳匹基公司)。乙型肝炎病毒表面抗原(HBsAg)和乙型肝炎病毒e抗原(HBeAg)定量檢測試劑盒(蘇州新波生物技術(shù)有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 反基因LNA設(shè)計與合成：從NCBI/Genome數(shù)據(jù)庫中搜索得到HBV全基因序列(U95551.1;GI：2182117)，利用RNAstructure5.0軟件的OligoWalk功能，根據(jù)反基因寡核苷酸作用原理及設(shè)計原則，設(shè)計并篩選出一條總自由能最低的互補(bǔ)于HBVS基因富含嘌呤區(qū)的寡核苷酸片段，修飾如下：1)LNA：5′-ACA△TCCA△GCGA△TA△GC-3′; 2)硫代寡核苷酸：5′-ACA#TCCA#GCGA#TA#GC-3′; 3)未修飾寡核苷酸：5′-ACATCCAGCGATAGC-3′;4)無關(guān)序列：5′-GCGTGGCTAAGCGAT-3′。以上各序列中，△代表LNA修飾，#代表S(硫)代修飾。各序列經(jīng)BLAST排除與人同源后由Genelink公司合成修飾并純化。

1.2.2 實(shí)驗設(shè)計與脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染：本實(shí)驗設(shè)對照組和實(shí)驗組。對照組包括空白對照組(blank control)和無關(guān)序列組(unrelated SEQ)。實(shí)驗組包括：1)未修飾寡核苷酸組(ODN)、硫代寡核苷酸組(S-ODN)和反基因鎖核酸組(AG-LNA); 2)含LNA量為0.2、0.4、0.6、0.8和1.0 μg/L組。將HepG2.2.15細(xì)胞按1×105個/mL接種于16孔培養(yǎng)板，每孔100 μL，共設(shè)定10個組，每組各設(shè)6個復(fù)孔，待細(xì)胞貼壁后，分別在各組每孔中加入含LNA的脂質(zhì)體-DMEM混合液1 mL，分別于2、4、6、8和10 d收集各孔培養(yǎng)上清液500 μL，保存于-20 ℃待測。轉(zhuǎn)染按脂質(zhì)體說明書操作。

1.2.3 培養(yǎng)上清液HBV DNA含量測定：采用實(shí)時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)法檢測。 取培養(yǎng)上清液50 μL， 加等量體積DNA提取液， 充分混勻， 100 ℃恒溫處理10 min， 1 200r/min離心5 min， 取2 μL上清于PCR反應(yīng)管中并加入反應(yīng)液， 總體積共25 μL， 各反應(yīng)管放入熒光定量PCR儀， 擴(kuò)增條件: 37 ℃保溫2 min， 94 ℃預(yù)變性3 min， 94 ℃ 5 s， 60 ℃ 40 s， 共35個循環(huán)。 由計算機(jī)軟件自動分析所收集的熒光信號并計算出定量結(jié)果， 采用計算對數(shù)平均值的方法計算HBV DNA拷貝數(shù)。

1.2.4 培養(yǎng)上清液HBsAg、HBeAg含量測定：采用時間分辨免疫熒光技術(shù)檢測， 每個樣品重復(fù)3次，嚴(yán)格按試劑盒說明書和儀器說明書操作， 濃度均以μg/L表示。

1.2.5 LNA對細(xì)胞的毒性檢測： 采用四甲基偶氮唑鹽(MTT)比色法檢測LNA對細(xì)胞代謝活性的影響。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1反基因鎖核酸對細(xì)胞內(nèi)病毒基因復(fù)制與蛋白表達(dá)的影響

寡核苷酸加入6 d后，反基因LNA組對病毒DNA復(fù)制和HBsAg、HBeAg表達(dá)均顯示出更強(qiáng)的抑制作用，抑制率分別為52.14%、57.48%和29.63%(表1)。

表1 反基因鎖核酸對細(xì)胞內(nèi)病毒基因復(fù)制與蛋白表達(dá)的影響

*Plt;0.05 compared with blank control and unrelated SEQ group.

2.2不同劑量反基因鎖核酸對細(xì)胞內(nèi)病毒基因復(fù)制與蛋白表達(dá)的影響

LNA加入6 d后，對細(xì)胞內(nèi)病毒基因復(fù)制和HBsAg、HBeAg表達(dá)的抑制作用均隨藥物濃度增加呈遞增趨勢，且當(dāng)濃度為0.6 μg/L時抑制作用最強(qiáng)，抑制率分別為60.99%、57.96%和25.18%(表2)。

2.3不同時間內(nèi)反基因鎖核酸對細(xì)胞內(nèi)病毒基因復(fù)制與蛋白表達(dá)的影響

鎖核酸加入后2、4、6、8和10 d，反基因LNA對細(xì)胞內(nèi)病毒基因復(fù)制的抑制率分別為26.19%、50.00%、51.77%、50.88%和48.80%；HBsAg表達(dá)的抑制率分別為31.07%、50.39%、57.49%、60.64%和60.09%；HBeAg的抑制率分別為16.67%、27.43%、28.89%、31.07%和24.02%(表3～5)。

表2 不同劑量反基因鎖核酸對細(xì)胞內(nèi)病毒基因復(fù)制與蛋白表達(dá)的影響

*Plt;0.05 compared with blank control group.

2.4 鎖核酸對細(xì)胞代謝的影響

用藥7 d后，鎖核酸組細(xì)胞活性(A值)為1.284±0.043，與對照組的1.255±0.038無差異。

3 討論

由于乙肝病毒 DNA聚合酶缺乏校對功能，在病毒復(fù)制過程中容易產(chǎn)生變異株，導(dǎo)致病毒對藥物治療敏感性下降或耐藥現(xiàn)象，因此，需要研究能阻斷靶基因與病毒聚合酶、轉(zhuǎn)錄因子等結(jié)合的藥物或療法。S基因區(qū)是乙型肝炎病毒基因的一個重要開放讀碼框，編碼的蛋白質(zhì)分子是乙型肝炎病毒表面抗原(hepatitis B virus surface antigen，HBsAg)的重要組成部分，不僅與病毒復(fù)制、轉(zhuǎn)錄、裝配和分泌過程有密切關(guān)系，還與病毒感染引起的細(xì)胞及體液免疫應(yīng)答反應(yīng)有關(guān)。

表3 不同時間內(nèi)反基因鎖核酸對細(xì)胞內(nèi)病毒基因復(fù)制的影響

*Plt;0.05 compared with blank control and unrelated SEQ group.

表4 不同時間內(nèi)反基因鎖核酸對細(xì)胞內(nèi)病毒HBsAg表達(dá)的影響

*Plt;0.05 compared with blank control and unrelated SEQ group.

表5 不同時間內(nèi)反基因鎖核酸對細(xì)胞內(nèi)病毒HBeAg表達(dá)的影響

*Plt;0.05 compared with blank control and unrelated SEQ group.

本研究針對HBVS基因富含嘌呤區(qū)設(shè)計合成反基因鎖核酸片段，由陽離子脂質(zhì)體介導(dǎo)轉(zhuǎn)染HepG2.2.15細(xì)胞系，通過檢測細(xì)胞培養(yǎng)上清液中HBV DNA、HBsAg、HBeAg等指標(biāo)含量變化來評價其療效。實(shí)驗結(jié)果顯示，反基因LNA對HBV DNA復(fù)制和HBsAg、HBeAg表達(dá)的抑制作用較硫代寡核苷酸更明顯，說明針對S基因設(shè)計的LNA具有較強(qiáng)的抑制能力及靶向特異性；給藥濃度不同，反基因LNA對細(xì)胞內(nèi)病毒基因復(fù)制與蛋白表達(dá)的抑制作用也不同，其抑制率隨LNA濃度增加呈遞增趨勢，出現(xiàn)一個平臺期，當(dāng)濃度為0.6 μg/L時抑制作用最強(qiáng)，原因可能是當(dāng)脂質(zhì)體量一定時，增加核酸用量，核酸分子與脂質(zhì)體囊泡表面的結(jié)合達(dá)到飽和狀態(tài)，此時，脂質(zhì)體的載藥率達(dá)到峰值，繼續(xù)增加核酸用量，相鄰的脂質(zhì)體寡聚囊泡相互融合，形成多層囊泡，使脂質(zhì)體囊泡的總表面積下降，從而導(dǎo)致載藥率下降；反基因LNA的抑制作用還呈時間依賴性，抑制率隨藥物作用時間延長呈上升趨勢，達(dá)到一個平臺期，之后，抑制率逐漸呈下降趨勢。

此外，MTT檢測結(jié)果證實(shí)鎖核酸對細(xì)胞的代謝活性無明顯毒性作用。

綜上所述，針對HBV S基因富含嘌呤區(qū)的反基因鎖核酸分子，體外能有效抑制病毒基因復(fù)制和蛋白表達(dá)，為病毒性乙型肝炎反基因治療提供理論和實(shí)驗依據(jù)。

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新聞點(diǎn)擊

食物太咸會導(dǎo)致鈣流失

據(jù)美國國家科學(xué)院學(xué)報(PNAS)網(wǎng)站(2012-08-06)報道，在加拿大有研究發(fā)現(xiàn)，因為身體會調(diào)節(jié)鈉與鈣的濃度，當(dāng)攝取太多的鈉鹽時，納會通過尿液排出，但同時鈣也會隨之進(jìn)入尿液一起排出體外。而當(dāng)尿液中含有高量的鈣時，就會引起腎結(jié)石，然后身體里的鈣質(zhì)減少了，骨頭所需的鈣質(zhì)不足，會導(dǎo)致骨質(zhì)疏松。

加拿大研究員通過動物及細(xì)胞實(shí)驗發(fā)現(xiàn)了吃重咸的人會容易出現(xiàn)腎結(jié)石及骨質(zhì)疏松的原因，研究員表示，當(dāng)身體排出鈉離子時，鈣也會隨著尿液一起排出。身體里重要的離子不只鈉與鈣，其中還有鎂也是調(diào)節(jié)身體運(yùn)作重要的物質(zhì)，而鈣又會與鎂同時調(diào)節(jié)身體里許多機(jī)能，如肌肉的收縮等，因此，當(dāng)鈣流失時也會影響鎂在體內(nèi)的含量，導(dǎo)致身體的生理機(jī)能失調(diào)。

所以這就是為何一直鼓勵每日低鹽飲食的原因，吃太多鹽除了會引發(fā)心血管疾病外，也會導(dǎo)致腎結(jié)石及骨質(zhì)疏松。體內(nèi)礦物質(zhì)微量元素不平衡時，會讓身體機(jī)能失常，一般大眾都知道要補(bǔ)充鈣質(zhì)，但事實(shí)是其他礦物質(zhì)微量元素都要一起補(bǔ)充才能發(fā)揮最大功效，單獨(dú)一種礦物質(zhì)微量元素濃度太高對身體都是不好的。

腎結(jié)石跟骨質(zhì)疏松是目前滿常見的疾病，且發(fā)生率越來越頻繁，或許通過飲食的改變，就能降低這類疾病的發(fā)生，均衡飲食是維持身體健康的重要因素。

久坐不站增加肥胖與疾病風(fēng)險

據(jù)美國國家科學(xué)院學(xué)報(PNAS)網(wǎng)站(2012-08-06)報道，巴西一份最新的研究指出，全球每年有530萬人死于缺乏運(yùn)動的相關(guān)疾病，比吸煙導(dǎo)致的死亡率還高。

現(xiàn)在很多上班族或是學(xué)生，長期坐著辦公或上課，到了假日也很少出去運(yùn)動，隨之漸漸肥胖，心血管疾病等也隨之發(fā)生。美國也有最新研究指出，調(diào)查167 000人，發(fā)現(xiàn)成年人每天看電視少于2 h，一天坐著時間減到3 h以內(nèi)，平均壽命能多2年，就是要告訴大家不要久坐不動。長期坐著會導(dǎo)致身體的循環(huán)不佳，呼吸不暢，腸胃蠕動也不好，久了身體自然會變差，例如心臟疾病、2型糖尿病、一些癌癥等跟不愛動有很大的關(guān)聯(lián)。

其實(shí)平常上班要運(yùn)動也不必強(qiáng)烈運(yùn)動到汗流不止，一般坐在位子上也能伸展身體，甚至是每隔一段時間站起來走一下，假日也可以進(jìn)行戶外運(yùn)動。除了運(yùn)動外，現(xiàn)代人也缺乏均衡飲食，營養(yǎng)補(bǔ)充不足，應(yīng)調(diào)整飲食，增加運(yùn)動，促進(jìn)新陳代謝，補(bǔ)充身體抗氧化物，維持健康。

Anti-gene locked nucleic acid(LNA) inhibits HBVSgene expressioninvitro

LUO Yan-hong, DENG Yi-bin*, ZOU Jia-jun

(Center for Medical Laboratory Science， the Clinical College， Youjiang Medical University for Nationalities， Baise 533000， China)

ObjectiveTo investigate the inhibitory effects of hepatitis B virus(HBV) S gene-specific anti-gene locked nucleic acid(LNA) on HBV replication and expression in hepG2.2.15 cells.MethodsThe anti-gene LNA which were complementary to the purine rich region of the HBV S gene was synthesized and transfected into HepG2 2.2.15 cells by cationic liposomes. The HBsAg, HBeAg and HBV DNA of supernatants were tested by time-resolved fluorescence immune Assay(TRFIA) and real-time fluorescent quantitative polymerase chain reaction(FQ-PCR) at 2, 4, 6, 8 and 10 d after treatment. LNA’s cyto-toxicity on cell was evaluated by methyl thiazolyl tetrazolium(MTT) method.ResultsThe anti-gene LNA targeting at the purine rich region of HBV S gene showed significantly inhibitory effects on replication of HBV DNA and the expression of HBsAg and HBeAg with the inhibition rates of 52.14%, 57.48% and 29.63% respectively after 6 days.There’s no obvious toxicity on cell.ConclusionsAnti-gene locked nucleic acid targeting at the purine rich region of HBV S gene has shown significant inhibition on HBVinvitro.It has a therapeutic potential for the treatment of patients infected with HBV.

cationic liposomes; hepatitis B virus; locked nucleic acid; anti-gene therapy

2013-06-13

2013-10-09

廣西壯族自治區(qū)教育廳項目(200911MS187)

*通信作者(correspondingauthor)： dyb0776@163.com

1001-6325(2014)02-0206-05

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A