周成江，張 姝，姜樹原，黃麗華，呂國蔚，張顏波，吉訓(xùn)明，邵 國，，*

(1.包頭醫(yī)學(xué)院 生物醫(yī)學(xué)研究中心 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)部， 內(nèi)蒙古 包頭 014010；2.首都醫(yī)科大學(xué)低氧醫(yī)學(xué)研究所，北京 100069； 3.泰山醫(yī)學(xué)院 附屬醫(yī)院 神經(jīng)內(nèi)科， 山東 泰安 217000; 4.首都醫(yī)科大學(xué)附屬宣武醫(yī)學(xué)院 低氧醫(yī)學(xué)研究所， 北京 100053)

研究論文

DNA甲基轉(zhuǎn)移酶1、3A和3B在低氧預(yù)適應(yīng)小鼠大腦中的表達(dá)

周成江1#，張 姝1#，姜樹原1，黃麗華1，呂國蔚2，張顏波3，吉訓(xùn)明4，邵 國1，2，4*

(1.包頭醫(yī)學(xué)院 生物醫(yī)學(xué)研究中心 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)部， 內(nèi)蒙古 包頭 014010；2.首都醫(yī)科大學(xué)低氧醫(yī)學(xué)研究所，北京 100069； 3.泰山醫(yī)學(xué)院 附屬醫(yī)院 神經(jīng)內(nèi)科， 山東 泰安 217000; 4.首都醫(yī)科大學(xué)附屬宣武醫(yī)學(xué)院 低氧醫(yī)學(xué)研究所， 北京 100053)

目的研究DNA甲基轉(zhuǎn)移酶(DNMT)1、3A和3B在低氧預(yù)適應(yīng)小鼠大腦中的變化，探討低氧預(yù)適應(yīng)形成過程中DNMTs的變化與腦保護(hù)作用的關(guān)系。方法小鼠隨機(jī)分成常氧組(H0)、低氧1次組(H1)或4次組(H4)，取大腦皮質(zhì)組織，應(yīng)用實(shí)時(shí)定量PCR 技術(shù)、免疫印跡技術(shù)和DNA甲基轉(zhuǎn)移酶活性檢測DNMT1、DNMT3A和DNMT3B mRNA和蛋白質(zhì)及DNMT活性。結(jié)果H1組和H4組DNMT3A和DNMT3B的mRNA和蛋白質(zhì)水平較H0組顯著降低(Plt;0.05)，H4組DNMT活性較H0組降低(Plt;0.05)。結(jié)論DNMT3A和3B水平及DNMT活力的變化可能與低氧預(yù)適應(yīng)小鼠獲得腦保護(hù)的關(guān)系密切。

低氧預(yù)適應(yīng)；大腦；DNA甲基轉(zhuǎn)移酶；小鼠

低氧預(yù)適應(yīng)的細(xì)胞組織機(jī)制的理論于上世紀(jì)60年代被提出[1]，這種組織和細(xì)胞機(jī)制是在極端條件下，細(xì)胞面臨生死抉擇時(shí)的基因表達(dá)的變化，而調(diào)控這些基因變化很可能涉及表觀遺傳學(xué)。表觀遺傳學(xué)指基因在不改變序列情況下如何與環(huán)境相互作用產(chǎn)生特定的表型[2]。低氧耐受的內(nèi)源性機(jī)制很可能是組織細(xì)胞在低氧特定環(huán)境下基因表達(dá)的變化。DNA甲基化是表觀遺傳修飾的一種重要方式，催化該反應(yīng)的酶為DNA(胞嘧啶-C5)甲基轉(zhuǎn)移酶(DNMT)。研究顯示DNMT1的蛋白水平降低可以保護(hù)神經(jīng)元的缺血損傷[3]。因此DNMTs很可能是極端條件下細(xì)胞面臨生死抉擇時(shí)調(diào)節(jié)基因表達(dá)的重要分子。本研究利用急性重復(fù)低氧小鼠模型,研究成年小鼠大腦皮質(zhì)組織DNMTs的變化,探討其與神經(jīng)細(xì)胞保護(hù)的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物及試劑

清潔級18～22 g雄性昆明小鼠(6～8周)內(nèi)蒙古大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，合格證號:SCXK(蒙)2002；trizol，superscript Ⅲ(Invitrogen 公司)；2× real-time PCR Mix(Roche公司)；兔源DNMT、DNMT3A和DNMT3B多克隆抗體(Santa Cruze公司)；鼠源β-actin單克隆抗體(Sigma公司)；辣根過氧化物酶標(biāo)記羊抗兔二抗和驢抗鼠二抗(北京博奧森生物技術(shù)有限公司)；BCA 試劑(Pierce公司)；EpiQuik Nuclear Extraction Kit和EpiQuik DNMT activity/inhibition assay Ultra kit(Epigentek公司)；其余試劑為國產(chǎn)試劑。

1.2 動(dòng)物模型復(fù)制

將小鼠隨機(jī)分為3組： 對照組(H0)， 低氧1次組(H1)和 低氧4次組(H4)。低氧4次組的低氧耐受時(shí)間為(78.7±7.9)min，顯示成功復(fù)制了急性重復(fù)低氧小鼠模型。低氧結(jié)束后立即斷頭取大腦皮質(zhì)組織，-70 ℃凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 RNA提取及實(shí)時(shí)定量PCR

按照說明書方法提取小鼠大腦皮質(zhì)總RNA,紫外分光光度計(jì)檢測RNA純度和含量。取2 μg RNA按照反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)試劑盒進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄PCR，得到20 μL cDNA產(chǎn)物-20 ℃保存。使用ABI的96孔板進(jìn)行PCR反應(yīng)，每孔依次加入2×real-time PCR Mix 12.5 μL，cDNA 1 μL，上游和下游引物各1 μL(引物序列見下表)，加雙蒸水至25 μL，在ABI 7900 real-time PCR反應(yīng)儀上反應(yīng)，每個(gè)樣本設(shè)3個(gè)復(fù)孔。反應(yīng)參數(shù)：94 ℃預(yù)變性3 min，再進(jìn)行92 ℃，30 s；54.5 ℃，35 s；72 ℃，30 s(40 cycles)，最后72 ℃延伸5 min停止反應(yīng)。實(shí)時(shí)定量PCR結(jié)果以ΔΔCT法計(jì)算，用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示數(shù)值。

1.4 免疫印記

使用RIAP緩沖液裂解皮質(zhì)組織, 用BCA試劑測定蛋白含量, 通過電泳緩沖液調(diào)整各組含量為4 μg/μL,每個(gè)樣本上樣量為80 μg, 在10% 聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)進(jìn)行電泳后轉(zhuǎn)移至聚偏二氟乙烯膜(PVDF膜), 預(yù)染蛋白標(biāo)準(zhǔn)分子質(zhì)量確定蛋白分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)位置。 用含10%脫脂奶粉Tris Tween鹽緩沖液(TTBS)液封閉, TTBS洗10 min×3；加入1抗，4 ℃振蕩孵育過夜，TTBS洗10 min×3；1比10 000加入辣根過氧化物酶標(biāo)記相應(yīng)的二抗,37 ℃振蕩孵育1 h, TTBS洗10 min×3；按Pierce公司的ECL試劑盒進(jìn)行熒光顯色反應(yīng)。暗室中曝光，顯影，定影。用分析軟件bandscan分析每個(gè)條帶的吸光度值，以目的蛋白豐度/β-actin蛋白吸光度比值的均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差來表示。

1.5 DNMT活力實(shí)驗(yàn)

按照試劑盒說明提取核蛋白及檢測小鼠大腦皮質(zhì)組織DNMT活力。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，用SPSS10.0數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)軟件ANOVA和Tukey對組間數(shù)據(jù)進(jìn)行處理和分析。

名稱正向引物反向引物DNMT1F：5′?ACTCTGACAAAAAGGATGCACC?3′R：5′?CAAGGGCGAACCTTCTTGG?3′DNMT3AF：5′?GGCCGAATTGTGTCTTGGTG?3′R：5′?CCATCTCCGAACCACATGAC?3′DNMT3BF：5′?AAGCTCCCGGCTGTCTAAGA?3′R：5′?CTGCGTGTAATTCAGAAGGCT?3′β?actinF：5′?GGCTGTATTCCCCTCCATCG?3′R：5′?CCAGTTGGTAACAATGCCATGT?3′

2 結(jié)果

2.1 mRNA的檢測

各組間未見DNMT1 mRNA有差異，H0組DNMT3A 和DNMT3B mRNA高于H1和H4組(表1)。

2.2 DNMT蛋白的檢測

各組間未見DNMT1 蛋白表達(dá)有差異。H1組和H4組較H0組DNMT3A和DNMT3B顯著性降低 (Plt;0.05)(圖1)。

2.3 DNMT活性的檢查

H0組、H1組和H4組大腦皮質(zhì)組織中DNMT的活性，H0組的活性為0.33±0.018， H1組的活性為0.31±0.023，H4組的活性為0.29±0.010(Plt;0.05, H4vsH0,n=6)，急性重復(fù)低氧預(yù)適應(yīng)使DNMT的活性降低(圖2)。

3 討論

急性重復(fù)低氧預(yù)適應(yīng)小鼠的顯著特征是低氧耐受時(shí)間呈線性增加[4-7]，同時(shí)伴有大量基因表達(dá)的改變[6]。研究發(fā)現(xiàn)還低氧預(yù)適應(yīng)可以使小鼠空間學(xué)習(xí)記憶能力增加[7]。表觀遺傳學(xué)機(jī)制在正常的大腦功能和異常的神經(jīng)現(xiàn)象中的作用已有報(bào)道[8]，研究報(bào)道DNMTS/1小鼠對溫和的缺血損傷有耐受[9]，DNMT1的蛋白水平降低可以保護(hù)神經(jīng)元的缺血損傷[3]。DNMT變化意味著其在低氧環(huán)境下維持大腦功能方面有重要作用。

*Plt;0.05 compared with H0.

*Plt;0.05 compared with H0圖1 免疫印跡分析DNMT1、DNMT3A 和DNMT3B在小鼠大腦皮質(zhì)中的表達(dá)

*Plt;0.05 compared with H0圖2 H0、H1和H4組小鼠大腦皮層中DNMT活性Fig 2 DNMT activity in the cerebral cortex of the mice in H0、H1 and H4(n=6)

研究顯示蒙古沙鼠經(jīng)短暫全腦缺血處理后6、12和24 h神經(jīng)元DNMT1不發(fā)生變化，缺血處理后2、4、5和7 d神經(jīng)元DNMT1降低[10]。因此DNMT在缺血/低氧耐受中必定扮演了重要角色。雖然本研究中DNMT1的mRNA和蛋白質(zhì)在H0、H1和H4組小鼠之間沒有顯著差異。根據(jù)研究報(bào)道可以推論DNMT1在低氧條件下的變化可能有時(shí)間依賴性[10]，由于本研究的H1組和H4組與的低氧暴露時(shí)間均低于24 h，所以DNMT1在急性重復(fù)低氧耐受中的作用可能不是主要的。本研究顯示急性重復(fù)低氧使DNMT3A和DNMT3B在mRNA和蛋白水平表達(dá)均降低，DNMT活性也發(fā)生了降低。DNMT活性的變化從另一個(gè)側(cè)面驗(yàn)證了低氧預(yù)適應(yīng)過程中DNMT3A和DNMT3B的變化。DNMT3A和DNMT3B的功能是DNA甲基化的重頭合成，DNMT3A和DNMT3B在急性重復(fù)低氧下的變化可能意味著新的DNA甲基化模式的建立。根據(jù)“好的基因?qū)箟牡幕颉崩碚揫9]，新的DNA甲基化模式使“好的基因”表達(dá)增加并提高了神經(jīng)細(xì)胞對缺血/低氧的耐受。

急性重復(fù)低氧預(yù)適應(yīng)的細(xì)胞組織分子機(jī)制可能是使腦保護(hù)基因“好的基因”表達(dá)上調(diào)并使腦損傷基因“壞的基因”表達(dá)下調(diào)[6]，而DNMT在腦保護(hù)作用中的可能是通過調(diào)節(jié)腦保護(hù)基因“好的基因”和腦損傷基因“壞的基因”實(shí)現(xiàn)的。本研究中急性重復(fù)低氧預(yù)適應(yīng)小鼠海馬中DNMT3A和DNMT3B表達(dá)降低及DNMT活性降低可能是急性重復(fù)低氧預(yù)適應(yīng)腦保護(hù)獲得的重要步驟。DNMT抑制劑5-Aza-dC處理后發(fā)現(xiàn)神經(jīng)細(xì)胞可以提高對缺血的耐受[11]和DNMT1的蛋白水平降低可以保護(hù)神經(jīng)元的缺血損傷顯示DNMT在神經(jīng)細(xì)胞缺血/低氧耐受中具有重要作用[3]。而要明確DNMT1、DNMT3A和DNMT3B在腦保護(hù)中的作用則需要更深入的研究。

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The expression of DNA methyltransferases 1, 3A and 3B in the brain of hypoxic preconditioned mice

ZHOU Cheng-jiang1#, ZHANG Shu1#, JIANG Shu-yuan1, HUANG Li-hua1, Lü Guo-wei2,ZHANG Yan-bo3, JI Xun-ming4, SHAO Guo1,2,4*

(1.Biomedicine Research Center and Basic Medical Department, BaoTou Medical College, Baotou 014010; 2.Institute for Hypoxia Medicine,Capital Medical University, Beijing 100069; 3.Dept. of Neurology, Affiliated Hospital of Taishan Medical College, Tai’an 271000;4.Institute for Hypoxia Medicine, Xuanwu Hospital, Capital Medical University, Beijing 100053,China)

ObjectiveTo study the changes of DNA methyltransferases (DNMT) in the brain of mouse with acute hypoxia.MethodsMice were randomly divided into control group (H0), hypoxia group (H1) and hypoxia for 4 runs group (H4). Real-time PCR, Western blot and methyltransferase activity assay were used to detect the changes of three kinds of DNMTs.ResultsmRNA and protein levels of DNMT3A and DNMT3B were found to be decreased in H1 and H4 (Plt;0.05). The activity of DNA methyltransferase was decreased in H4(Plt;0.05).ConclusionsThe changes of DNA methyltransferase may be closely related to protection of the brain in hypoxic preconditioned mice.

hypoxic preconditioning; brain; DNA methyltransferase; mouse

2013-04-02

2013-08-17

國家自然科學(xué)基金(81060212,81160244,81360316)；內(nèi)蒙古自然科學(xué)基金(2010BS1104)；中國博士后基金(20080430851)；內(nèi)蒙古自治區(qū)高等學(xué)校科研項(xiàng)目(NJZY12221，NJZY12225)；內(nèi)蒙古自治區(qū)高等學(xué)校青年科技英才支持計(jì)劃資助(NJYT-13-A10)；教育部留學(xué)回國人員科研啟動(dòng)基金(46批)

*通信作者：shao_guo_china@163.com

#對本文有相同貢獻(xiàn)

1001-6325(2014)02-0151-04

R339.5

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