高之峰，張建福，費(fèi)素娟，汪詩卉，董秋菊，韓紅霞

(徐州醫(yī)學(xué)院 1.附屬醫(yī)院 消化內(nèi)科；2.生理學(xué)教研室， 江蘇 徐州 221002)

#對本文有相同貢獻(xiàn)

研究論文

食欲素A促人胃癌SGC7901細(xì)胞凋亡

高之峰1#，張建福2#，費(fèi)素娟1*，汪詩卉1，董秋菊1，韓紅霞1

(徐州醫(yī)學(xué)院 1.附屬醫(yī)院 消化內(nèi)科；2.生理學(xué)教研室， 江蘇 徐州 221002)

目的觀察食欲素A對胃癌SGC7901細(xì)胞生長的影響，并初步探討其機(jī)制。方法常規(guī)培養(yǎng)胃癌SGC7901細(xì)胞，單獨(dú)食欲素A處理及食欲素A受體拮抗劑SB408124干預(yù)后再用食欲素A作用，MTT法檢測藥物對SGC7901細(xì)胞抑制率；Hoechst33258熒光染色法及流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡；Western blot方法檢測BCL-2、BAX、Cyt c和活化caspase-3蛋白的表達(dá)。結(jié)果食欲素A呈劑量-時(shí)間依賴性的抑制胃癌SGC7901細(xì)胞增殖，其中1.0 μmol/L 食欲素A作用24h對胃癌細(xì)胞增殖的抑制作用最強(qiáng)，抑制率為65.32%±2.51%(Plt;0.01)；食欲素A組可見較多凋亡細(xì)胞：胞核或胞質(zhì)內(nèi)可見濃染致密的藍(lán)色熒光，有明顯的核固縮，SB408124干預(yù)后，凋亡細(xì)胞數(shù)量明顯減少(Plt;0.05)；食欲素A作用后，凋亡率為59.52%±1.38%，而SB408124干預(yù)后，凋亡率降至38.96%±1.82%(Plt;0.05)；食欲素A可上調(diào)凋亡相關(guān)蛋白BAX、Cyt c及活化caspase-3的表達(dá)，下調(diào)抗凋亡蛋白BCL-2的表達(dá)(Plt;0.05)，SB408124干預(yù)后，食欲素A作用減弱。結(jié)論食欲素A對胃癌SGC7901細(xì)胞生長具有明顯的抑制增殖和促凋亡作用；食欲素A的作用是通過其選擇性受體實(shí)現(xiàn)的。

食欲素A；SGC7901細(xì)胞；SB408124；凋亡

食欲素(orexin)是下丘腦區(qū)發(fā)現(xiàn)的一類神經(jīng)肽[1]，包括食欲素A(orexin A, OA)和食欲素B(orexin B)。Orexin的基本功能是調(diào)節(jié)食欲、睡眠-覺醒周期、能量平衡、心血管和內(nèi)分泌等[2]。近年來，國外有文獻(xiàn)報(bào)道，orexin對離體培養(yǎng)的結(jié)腸癌細(xì)胞、神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞等有促凋亡作用。

胃癌是最常見的惡性腫瘤之一，晚期治療主要為化療為主的綜合治療，而化療藥物的諸多不良反應(yīng)限制了治療效果，因此選擇在化療過程中對腫瘤細(xì)胞最大限度的殺傷，而對正常細(xì)胞毒性最低的藥物越來越引起重視。是否orexin對胃癌細(xì)胞同樣有殺傷作用從而用于胃癌的治療，降低化療的不良反應(yīng)，目前國內(nèi)尚無此方面研究報(bào)道，本實(shí)驗(yàn)以orexin A為研究對象，觀察其對胃癌SGC7901細(xì)胞生長的影響，并初步探討其可能的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

胃癌SGC7901細(xì)胞系(北京腫瘤研究所)；orexin A、orexin-1受體選擇性拮抗劑(SB408124，SB)和Hoechst33258(Sigma公司)；Avnnexin V-FITC細(xì)胞凋亡檢測試劑盒(南京凱基生物發(fā)展有限公司)；鼠抗BCL-2單克隆抗體、鼠抗BAX單克隆抗體、堿磷酶標(biāo)記馬抗小鼠IgG抗體、堿磷酶標(biāo)記馬抗小鼠β-actin和小鼠抗β-actin單克隆抗體(北京中杉生物技術(shù)有限公司)；細(xì)胞色素c小鼠單克隆抗體、堿磷酶標(biāo)記的羊抗兔抗體和抗caspase-3 (激活型)兔單克隆抗體(碧云天生物技術(shù)研究所)；四甲基偶氮唑藍(lán)(MTT)(Amresco公司)。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)及分組：SGC7901細(xì)胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基中，置于37 ℃、5% CO2和相對濕度95%的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，2～3 d換液，每3～4天傳代1次，實(shí)驗(yàn)時(shí)選用對數(shù)增殖期細(xì)胞。實(shí)驗(yàn)分為正常對照組(N組，即正常培養(yǎng)的胃癌細(xì)胞)、溶劑對照組(0.3% 二甲亞砜-DMSO)、orexin A組(0.01、0.1和1.0 μmol/L)、SB408124+ orexin A組(10 μmol/L SB408124預(yù)處理，1 h后加1.0 μmol/L orexin A)。

1.2.2 MTT法檢測細(xì)胞增殖抑制率：取SGC7901細(xì)胞5×104/mL接種于96孔板培養(yǎng)，待細(xì)胞貼壁后，按實(shí)驗(yàn)分組，分別培養(yǎng)6、12和24 h后，每孔加入5 g/L的MTT 20 μL。4 h后，吸盡各孔培養(yǎng)液，每孔加DMSO 200 μL，輕輕震蕩10 min后，用酶標(biāo)儀檢測490 nm處各孔吸光度A值，計(jì)算細(xì)胞抑制率。細(xì)胞抑制率(%)=(1-實(shí)驗(yàn)組各孔平均A值/正常對照組各孔平均A值)×100%，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.3 Hoechst33258熒光染色法觀察凋亡細(xì)胞的形態(tài)學(xué)變化：細(xì)胞接種于6孔板，常規(guī)培養(yǎng)。按分組實(shí)驗(yàn)后，吸盡培養(yǎng)液，加入0.5 mL 40g /L的多聚甲醛液固定細(xì)胞10 min；去固定液，用0.01 mol/L的PBS洗2次，洗滌時(shí)用手輕輕晃動，吸盡液體；加入0.5 mL Hoechst 33258染色液，37 ℃染色15 min；去染色液，用PBS洗2次；熒光顯微鏡下觀察，激發(fā)波長為350 nm，發(fā)射波長為460 nm，細(xì)胞核呈致密濃染或呈碎塊狀致密濃染為凋亡陽性細(xì)胞，計(jì)數(shù)并拍照保存。

1.2.3 流式細(xì)胞技術(shù)檢測細(xì)胞凋亡率：取對數(shù)增殖期細(xì)胞以每孔1×105個(gè)/mL的細(xì)胞濃度接種于6孔板，每孔2 mL，于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)過夜，待細(xì)胞貼壁后，按實(shí)驗(yàn)分組藥物作用24 h后，收集細(xì)胞，用0.25%胰蛋白酶消化后離心，1 000 r/min離心5 min，棄上清，用PBS洗滌2次后，將細(xì)胞重懸于500 μL結(jié)合緩沖液中，加入20 μL Annexin V-FITC和5 μL碘化丙啶(PI)中，輕輕混勻，室溫避光5 min，用流式細(xì)胞儀檢測。

1.2.4 Western blot法檢測凋亡蛋白 BAX、BCL-2、Cyt c和活化caspase-3的表達(dá)：收集不同處理組的SGC7901細(xì)胞，加入蛋白裂解液，提取蛋白，進(jìn)行蛋白定量，取蛋白樣品進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳，半干轉(zhuǎn)至硝酸纖維膜上，加入BCL-2、BAX、Cyt c和caspase-3抗體，4 ℃冰箱過夜孵育后洗滌，加入二抗，室溫孵育2 h，用緩沖液洗滌(配制：Tris 1.21 g,NaCl 5.84 g，Tween-20 1 mL，加雙蒸水定容至1 000 mL，調(diào)pH至7.5)，洗滌后BCIP/NBT法顯色，檢測細(xì)胞中相關(guān)蛋白的表達(dá)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 不同濃度orexin A對SGC7901細(xì)胞增殖的抑制作用

3種劑量的orexin A分別處理6、12和24 h后，SGC7901細(xì)胞呈現(xiàn)出時(shí)間-濃度依賴性增殖抑制；其中1.0 μmol/L orexin A作用24 h對SGC7901細(xì)胞抑制作用最強(qiáng)(Plt;0.01)，故在以后的實(shí)驗(yàn)中orexin A均采用1.0 μmol/L作用24 h(圖1)。

（29）妙用之因，神明之契，必有奧旨，願釋鄙懹。（《太上說玄天大聖真武本傳神呪妙經(jīng)註》卷三，《中華道藏》30/554）

*Plt;0.01 compared with DMSO group圖1 不同濃度orexin A分別作用6、12和24 h對SGC7901細(xì)胞的抑制作用Fig 1 Inhibitory effect of orexin A with different con- centrations in different times on viability of

2.2 Orexin A及SB408124對SGC7901細(xì)胞抑制率的影響

Orexin A處理后，細(xì)胞抑制率顯著提高，經(jīng)SB408124干預(yù)，細(xì)胞抑制率回降(Plt;0.01)，但仍高于對照組(Plt;0.05)(圖2)。

2.3 熒光染色觀察orexin A及SB408124對胃癌細(xì)胞形態(tài)及凋亡率的變化

鏡下orexin A組可見較為典型的凋亡形態(tài)學(xué)變化：胞核皺縮，熒光強(qiáng)度增強(qiáng)，凋亡小體形成等，凋亡細(xì)胞增多；而SB408124干預(yù)后，同樣可見典型的凋亡細(xì)胞及形態(tài)學(xué)變化但凋亡細(xì)胞數(shù)量減少(Plt;0.05)(圖3)。

*Plt;0.05 compared with DMSO group； #Plt;0.05 compared with orexin A group and DMSO group圖2 單獨(dú)orexin A及SB408124干預(yù)分別作用對SGC7901細(xì)胞的抑制作用Fig 2 Inhibitory effect of orexin A and pretreatment with SB408124 on viability of SGC7901 cell

2.4 流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡率

Orexin A組，細(xì)胞凋亡率明顯增高(Plt;0.05)，經(jīng)SB408124干預(yù)，凋亡率回降，仍高于對照組(Plt;0.05)(圖4)

2.5 Orexin A及SB408124對胃癌SGC7901細(xì)胞蛋白BCL-2、BAX、活化caspase-3表達(dá)的影響

Orexin A處理后，BAX、Cyt c和活化caspase-3蛋白表達(dá)上調(diào)，BCL-2蛋白表達(dá)顯著減少(Plt;0.05)。SB408124干預(yù)后，BAX、Cyt c和活化caspase-3蛋白表達(dá)下調(diào)，BCL-2蛋白表達(dá)增加(Plt;0.05)(圖5)。

3 討論

國外文獻(xiàn)報(bào)道食欲素對結(jié)腸癌細(xì)胞、神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞等有抑增殖促凋亡作用[3]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，orexin A能呈劑量-時(shí)間依賴性的抑制SGC7901細(xì)胞的增殖，orexin A作用于SGC7901后凋亡率明顯增高。表明orexin A對胃癌SGC7901細(xì)胞同樣具有抑增殖促凋亡作用。

細(xì)胞對死亡信號的敏感性取決于胞內(nèi)BCL-2/BAX競爭性的二聚體化過程，隨BCL-2蛋白表達(dá)量的下降，有利于BAX二聚體形成，細(xì)胞發(fā)生凋亡[4-6]。

*Plt;0.05 compared with DMSO group； #Plt;0.05 compared with orexin A group圖3 單獨(dú)orexin A及SB408124干預(yù)分別作用24 h對SGC7901細(xì)胞凋亡的影響Fig 3 Effect of orexin A and pretreatment with SB408124 on cell apoptosis in SGC7901 cell (±s,%, n=5)

A.N; B.DMSO; C.OA; D.SB+OA;*Plt;0.05 compared with control group； #Plt;0.05 compared with orexin A group圖4 單獨(dú)orexin A及SB408124干預(yù)分別作用對SGC7901細(xì)胞凋亡率的影響Fig 4 Effect of orexin A and pretreatment with SB408124 on cell apoptosis in SGC7901 cell(±s, %, n=3)

Orexin有orexin-1受體(OX1R)和orexin-2受體(OX2R)二種亞型，SB408124是OX1R的選擇性拮抗劑[9-10]，orexin A作用于結(jié)腸癌細(xì)胞HT29-D4膜上的OX1R，誘導(dǎo)Cyt c釋放，激活線粒體/細(xì)胞色素c介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，從而引發(fā)了orexin 對結(jié)腸癌細(xì)胞的促凋亡作用[11]。 本實(shí)驗(yàn)采用了單獨(dú)orexinA作用及SB408124干預(yù)后再用orexin A作用對比來觀察兩種處理方法對細(xì)胞的影響。結(jié)果顯示：與單獨(dú)orexin A作用比較，SB408124干預(yù)后，細(xì)胞抑制率、凋亡率均明顯下降；Cyt c及活化caspase-3蛋白的表達(dá)量也較單獨(dú)orexin A組下降。上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示本實(shí)驗(yàn)中orexin A對胃癌細(xì)胞的作用是通過OX1R實(shí)現(xiàn)的。

*Plt;0.05 compared with control group；#Plt;0.05 compared with orexin A group圖5 單獨(dú)orexin A及SB408124干預(yù)分別作用對SGC7901細(xì)胞BCL-2、BAX、Cyt c及活化caspase-3蛋白表達(dá)的影響

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)研究顯示orexin A對胃癌SGC7901細(xì)胞有明顯的抑制增殖和促凋亡的作用，而orexin A誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞凋亡的作用是通過其選擇性受體實(shí)現(xiàn)的，盡管具體的分子機(jī)制有待進(jìn)一步研究探索，但此研究結(jié)果也進(jìn)一步補(bǔ)充了orexin 的生物學(xué)功能，這也為腫瘤的預(yù)防、治療起到一定的指導(dǎo)作用。

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Orexin A promotes the apoptosis of human gastric cancer cell SGC7901

GAO Zhi-feng1#, ZHANG Jian-fu2#, FEI Su-juan1*, WANG Shi-hui1, DONG Qiu-ju1, HAN Hong-xia1

(1.Dept of Gastroenterology, the Affiliated Hospital of Xuzhou Medical College;2.Dept. of Physiology, Xuzhou Medical College, Xuzhou 221002, China)

ObjectiveTo explore the effect of orexin A on the growth of human gastric cancer cell line SGC7901 and its mechanisms.MethodsThe SGC7901 cells were treated by orexin A and SB408124 (an antagonist of orexin A receptor subtype 1). The MTT assay was used to detect growth inhibitory rates of orexin A on human gastric cell SGC7901. The apoptosis was determined by Hoechst 33258 fluorochrome staining and flow cytometric analysis; and we used Western blot to detect the expressions of BCL-2 BAX Cyt c and caspase-3.ResultsOrexin A can inhibit the growth of SGC7901 cells. This can be proved by a direct relationship between a longer time for cells to culture when given a higher dose of orexin A. The strongest inhibitory rate was 65.32%±2.51%, when we used 1.0 μmol/L orexin A treat for 24 h(Plt;0.01); we can see many apoptotic cells that the nuclear condensation in orexin A group，While cells that were pretreated with SB408124 showed the number of the native cell was decreased (Plt;0.05). After treated with orexin A, the apoptosis rate was 59.52%±1.38%， but when we pretreated with SB408124, the apoptosis rate decrease to 38.96%±1.82%；the expressions of BAX Cyt c and caspase-3 protein were increased, but the expression of BCL-2 was decreased(Plt;0.05). As mentioned above, the inhibitory effects of orexin A on SGC7901 cell were weakened by the pretreatment with SB408124.ConclusionsOrexin A significantly inhibits the growth of SGC7901 cells through inducing cell apoptosis. Its molecular mechanism is associated with OX1R.

orexin A; SGC7901 cell; SB408124; apoptosis

2013-04-07

2013-06-24

*通信作者(correspondingauthor)： xhbyjs@xzmc.edu.cn

1001-6325(2014)01-0098-06

R 735.2

A