孫愛平，孫書明，張國(guó)俊，王艷華，宋向鳳

(新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院 免疫學(xué)研究中心， 河南 新鄉(xiāng) 453003)

研究論文

熊果酸減輕LPS誘導(dǎo)的THP-1細(xì)胞損傷

孫愛平，孫書明，張國(guó)俊，王艷華，宋向鳳*

(新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院 免疫學(xué)研究中心， 河南 新鄉(xiāng) 453003)

目的探討熊果酸減輕脂多糖誘導(dǎo)的THP-1細(xì)胞損傷的作用及其機(jī)制。方法以脂多糖誘導(dǎo)的THP-1 炎性細(xì)胞為模型，MTT法檢測(cè)不同濃度的熊果酸(0.1、1、5、10、20、40和80 μmol/L) 對(duì)細(xì)胞增殖的影響，RT-PCR 法檢測(cè)TLR4、MCP-1和IL-6 mRNA 的表達(dá)，ELISA法檢測(cè)MCP-1和IL-6表達(dá)，Western blot法檢測(cè)P65、磷酸化P65蛋白表達(dá)，熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)檢測(cè)核轉(zhuǎn)錄因子κB(NF-κB)活性。結(jié)果與對(duì)照組比較，LPS作用組能顯著增高M(jìn)CP-1、TLR4、IL-6 mRNA 和MCP-1、IL-6、P65、磷酸化P65蛋白的表達(dá)并上調(diào)NF-κB 活性(Plt;0.05)；與LPS單獨(dú)作用組比較，熊果酸(1和5 μmol/L)干預(yù)組能夠顯著降低MCP-1、TLR4、IL-6 mRNA 和MCP-1、IL-6表達(dá)水平并下調(diào)NF-κB 活性(Plt;0.05)。結(jié)論熊果酸可能是通過下調(diào)NF-κB 活化減輕脂多糖誘導(dǎo)的THP-1 細(xì)胞的損傷。

熊果酸; THP-1細(xì)胞; TLR4;MCP-1; IL-6; NF-κB

熊果酸(ursolic acid，UA，3β-hydroxy-12-urs-12-en-28-oic acid) 又名烏索酸、烏蘇酸，屬于α-香樹脂烷(α-amyrin)型五環(huán)三萜類化合物[1-2]。它在自然界分布很廣，研究表明UA 具有廣泛的生物學(xué)效應(yīng)，其中抗腫瘤方面的報(bào)道最多[3-5]，而抗炎方面的作用及其相關(guān)機(jī)制研究卻報(bào)道較少[6]。

炎性反應(yīng)，俗稱發(fā)炎，對(duì)機(jī)體而言如一把“雙刃劍”[7]。它是機(jī)體的重要防御機(jī)制，同時(shí)也可產(chǎn)生大量的促炎性細(xì)胞因子，如IL-6、TNF-α、IFN-γ、MCP-1等[8]。單核細(xì)胞趨化蛋白-1(MCP-1)和白細(xì)胞介素(IL)-6是參與機(jī)體炎性反應(yīng)和一系列病理生理過程的重要介質(zhì)[9-10]。

本研究在細(xì)胞及分子水平探討了熊果酸對(duì)脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)誘導(dǎo)的THP-1 單核細(xì)胞增殖作用的影響，并從TLR4、MCP-1和IL-6的mRNA水平及NF-κB信號(hào)途徑的蛋白水平對(duì)其相關(guān)機(jī)制作了初步探討。

1 材料與方法

1.1 材料

人單核細(xì)胞系THP-1 細(xì)胞(免疫學(xué)研究中心保存)；熊果酸(Sigma公司，純度大于90%)；RPMI-1640 液體培養(yǎng)基(roswell park memorial institute-1640，Gibco公司)；小牛血清(中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院血液病研究所)；噻唑藍(lán)(MTT)和脂多糖(Sigma公司)；RNA提取試劑盒(Omega公司)；MCP-1和IL-6 ELISA試劑盒(Abcam公司)；一抗(兔抗人NF-κB P65和磷酸化P65)(北京博奧森生物技術(shù)有限公司)，二抗(HRP標(biāo)記羊抗兔IgG)(武漢博士德生物工程有限公司)；報(bào)告基因質(zhì)粒pNF-κB-luc(美國(guó)NIH欒好江博士惠贈(zèng))；Lipofecter脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑(碧云天生物技術(shù)有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)：THP-1細(xì)胞用含體積分?jǐn)?shù)為10%胎牛血清的新鮮RPMI-1640培養(yǎng)基培養(yǎng)，內(nèi)含各100 U/mL青霉素和鏈霉素，在37 ℃、體積分?jǐn)?shù)為5% CO2、飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，細(xì)胞濃度不超過1×109/L，2～3 d傳代1次。實(shí)驗(yàn)前換無血清培養(yǎng)基饑餓1 h，在實(shí)驗(yàn)中空白對(duì)照組均給予等體積RPMI-1640培養(yǎng)基。取生長(zhǎng)狀態(tài)良好的、對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)：將THP-1細(xì)胞以5×105個(gè)/mL接種于96孔板，200 μL/孔，分別加入不同濃度的UA(0.1、1、5、10、20、40和80 μmol/L)和不同濃度的LPS(1、10、100和1 000 μg/L)，另設(shè)空白對(duì)照組，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔，重復(fù)3次。在培養(yǎng)箱中作用24 h后，加入無血清RPMI-1640 培養(yǎng)基和5 μg/L MTT 溶液(9∶1)，37 ℃、5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育3 h；棄去上述培養(yǎng)液，加入二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide，DMSO)，微量振蕩器振蕩10 min 溶解藍(lán)紫色結(jié)晶，酶標(biāo)儀測(cè)定吸光度(測(cè)定波長(zhǎng)570 nm，參比波長(zhǎng)650 nm)并記錄A570。

1.2.3 TLR4、MCP-1和IL-6 mRNA表達(dá)的測(cè)定：將THP-1細(xì)胞以5×105/mL個(gè)接種于6孔板，3 mL/孔，加入10 μg/L的LPS，在培養(yǎng)箱中作用20 h后，給藥組給予不同濃度的UA(0.1、1、5，和10 μmol/L)誘導(dǎo)4 h。用RNA提取試劑盒提取總RNA，A260/280測(cè)定RNA純度。反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。于PCR反應(yīng)體系10 μL中加入模板cDNA 2 μL進(jìn)行PCR擴(kuò)增，GAPDH作為內(nèi)參，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。引物由蘇州金唯智生物科技有限公司合成，各引物序列見表1。PCR 產(chǎn)物經(jīng)含1.0 μg/mL 溴化乙錠(ethidium bromide，EB) 染色液的1.5%瓊脂糖凝膠電泳，分別以目的基因擴(kuò)增產(chǎn)物電泳條帶總灰度與GAPDH電泳條帶總灰度之比表示各自mRNA的相對(duì)強(qiáng)度。

1.2.4 ELISA法檢測(cè)MCP-1和IL-6：按試劑盒操作說明進(jìn)行。

1.2.5 蛋白質(zhì)印跡(Western blot)法檢測(cè)P65蛋白的表達(dá)： 將THP-1細(xì)胞以5×105/mL個(gè)接種于6 孔板，3 mL/孔，加入10 μg/L的LPS，在培養(yǎng)箱中作用20 h后，給藥組給予不同濃度的UA(0.1、1、5和10 μmol/L)誘導(dǎo)4 h。裂解細(xì)胞提取總蛋白，用G-250法進(jìn)行定量后，將含有等量蛋白的細(xì)胞裂解液用樣品緩沖液溶解，行SDS-PAGE電泳，用半干電轉(zhuǎn)方法轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜。用含質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5%脫脂奶粉的TBST封閉，結(jié)合一抗(兔抗人)。TBST漂洗，結(jié)合二抗(羊抗兔)。TBST再次漂洗,洗后的膜加入化學(xué)發(fā)光試劑(ECL),反應(yīng)2 min,暗室曝光顯影后沖洗膠片，后用激光掃描儀掃描，分別以目的蛋白總吸光度與β-actin蛋白總吸光度之比表示各自蛋白的相對(duì)強(qiáng)度。

表1 用于RT-PCR的引物序列Table 1 The primers used in RT-PCR

1.2.6 熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)檢測(cè)NF-κB表達(dá)：將THP-1細(xì)胞用無血清培養(yǎng)基洗滌，并調(diào)整細(xì)胞水平至2.5×106/mL待用。1 μg質(zhì)粒需要3.0 μL Lipofecter試劑，將其按比例混合入不完全RPMI 1640培養(yǎng)基中，渦旋劇烈振蕩30 s，室溫放置10 min后，每孔加入200 μL Lipofecter、質(zhì)粒DNA和無血清培養(yǎng)基混合物，再加入20 μL 2.5×109/L的細(xì)胞懸液，37 ℃ CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。1 h后每孔補(bǔ)充1 mL完全培養(yǎng)基,繼續(xù)培養(yǎng)32 h；之后，加入10 μg/L的LPS，在培養(yǎng)箱中作用20 h后，給藥組給予不同濃度的UA(0.1、1、5和10 μmol/L)誘導(dǎo)4 h后，收集細(xì)胞進(jìn)行熒光素酶活性檢測(cè)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 UA對(duì)THP-1細(xì)胞增殖的影響

熊果酸20、40和80 μmol/L可抑制THP-1細(xì)胞增殖(Plt;0.05)(圖1)，后續(xù)實(shí)驗(yàn)只使用0.1、1、5和10 μmol/L濃度(圖1)。用同樣方法檢測(cè)LPS對(duì)THP-1細(xì)胞增殖的影響發(fā)現(xiàn)10 μg/L的LPS對(duì)THP-1細(xì)胞的增殖作用最為明顯(Plt;0.05)，因此后續(xù)LPS誘導(dǎo)的THP-1細(xì)胞實(shí)驗(yàn)均用此濃度。

2.2 UA對(duì)LPS誘導(dǎo)的THP-1細(xì)胞中TLR4、MCP-1和IL-6 mRNA表達(dá)的影響

THP-1細(xì)胞經(jīng)LPS刺激后，TLR4、MCP-1和IL-6 mRNA表達(dá)均有顯著增加(Plt;0.05)；與LPS組相比，UA(0.1、1和5 μmol/L)干預(yù)組TLR4、MCP-1和IL-6 mRNA表達(dá)明顯降低(Plt;0.05)(圖2)。

*Plt;0.05 compared with control group圖1 不同濃度熊果酸對(duì)THP-1細(xì)胞增殖作用的影響Fig 1 Effect of ursolic acid on THP-1 proliferation

#Plt;0.05 compared with control group; *Plt;0.05 compared with LPS group圖2 不同濃度熊果酸對(duì)LPS誘導(dǎo)的THP-1細(xì)胞 TLR4、MCP-1和IL-6 mRNA的影響Fig 2 Effect of UA on TLR4、MCP-1 and IL-6 expressions of THP-1 cells induced by LPS(±s，n=3)

2.3 UA對(duì)LPS誘導(dǎo)的THP-1細(xì)胞中MCP-1和IL-6水平的影響

THP-1細(xì)胞經(jīng)LPS刺激后，MCP-1和IL-6顯著增加(Plt;0.05)；與LPS組相比，UA(0.1、1和5 μmol/L干預(yù)組可顯著降低MCP-1和IL-6水平(Plt;0.05)(圖3)。

#Plt;0.05 compared with control group; *Plt;0.05 compared with LPS group圖3 不同濃度熊果酸對(duì)LPS誘導(dǎo)的THP-1細(xì)胞MCP-1和IL-6的影響Fig 3 Effect of UA on MCP-1 and IL-6 expressions of THP-1 cells induced by LPS(±s，n=3)

2.4 UA對(duì)LPS誘導(dǎo)的THP-1細(xì)胞中P65和phospho-P65蛋白表達(dá)的影響

THP-1細(xì)胞經(jīng)LPS 刺激后，NF-κB家族中P65和phospho-P65的活性顯著增加(Plt;0.05)；與LPS組相比，UA(0.1、1和5 μmol/L)干預(yù)組可顯著降低P65和phospho-P65的活性(Plt;0.05)(圖4)。

2.5 UA對(duì)LPS誘導(dǎo)的THP-1細(xì)胞中熒光素酶報(bào)告基因影響

THP-1細(xì)胞經(jīng)LPS刺激后，NF-κB活性檢測(cè)值增高(Plt;0.05)；與LPS組相比，UA(1和5 μmol/L)干預(yù)組NF-κB活性檢測(cè)值明顯降低(Plt;0.05)(圖5)。

3 討論

炎性反應(yīng)對(duì)機(jī)體的影響具有雙面性[11]。在炎性反應(yīng)發(fā)生初期，當(dāng)巨噬細(xì)胞受到相應(yīng)刺激后便會(huì)被激活，這些活化的巨噬細(xì)胞可分泌MCP-1和IL-6，而MCP-1和IL-6又可通過特異性地作用于外周血中的單核細(xì)胞和細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)激活核因子-κB(nuclear factor，NF-κB)，造成單核細(xì)胞的進(jìn)一步募集和活化，進(jìn)而更多的炎性介質(zhì)釋放，這樣一個(gè)MCP-1和IL-6-NF-κB-MCP-1和IL-6惡性循環(huán)最終導(dǎo)致炎癥的進(jìn)一步發(fā)展[12-13]。因此，MCP-1和IL-6在炎性反應(yīng)的發(fā)生發(fā)展中起著舉足輕重的作用，降低MCP-1和IL-6的表達(dá)水平有助于阻止早期炎性反應(yīng)。NF-κB是一個(gè)經(jīng)典的核轉(zhuǎn)錄因子，在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中有5個(gè)家庭成員。生理狀態(tài)下，NF-κB通過對(duì)相關(guān)基因的適時(shí)準(zhǔn)確的轉(zhuǎn)錄調(diào)控,維持各種免疫細(xì)胞的正常功能[14]。研究發(fā)現(xiàn)，UA 可抑制佛波酯、TNF-α和H2O2對(duì)NF-κB 的激活作用，并且無細(xì)胞特異性[15]，另外，絕大多數(shù)炎性反應(yīng)通過NF-κB 途徑介導(dǎo)[16]。本研究表明LPS刺激而活化的THP-1細(xì)胞，在經(jīng)UA作用后，其合成的炎性反應(yīng)因子MCP-1、IL-6在mRNA和蛋白水平會(huì)有所降低，說明UA能減輕LPS誘導(dǎo)的THP-1細(xì)胞的損傷，而對(duì)P65、磷酸化P65蛋白水平和熒光素酶報(bào)告基因的檢測(cè)，提示熊果酸對(duì)LPS刺激THP-1細(xì)胞損傷減輕作用可能是通過影響NF-κB通路的活性來實(shí)現(xiàn)的。Toll樣受體4(Toll-1ike receptor 4, TLR4)是Toll樣受體家族(Toll-1ike receptors, TLRs)的成員之一，是哺乳動(dòng)物將細(xì)胞外抗原識(shí)別信息向細(xì)胞內(nèi)傳遞并引發(fā)炎性反應(yīng)的關(guān)鍵跨膜蛋白[17]。TLR4廣泛分布于各類與免疫相關(guān)細(xì)胞，本實(shí)驗(yàn)通過對(duì)TLR4的檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)UA減輕LPS對(duì)THP-1細(xì)胞的損傷作用可能是通過TLR4，進(jìn)而影響NF-κB通路活性而實(shí)現(xiàn)的。

#Plt;0.05 compared with control group;*Plt;0.05 compared with LPS group圖4 不同濃度熊果酸對(duì)LPS誘導(dǎo)的THP-1細(xì)胞P65和phospho-P65的影響Fig 4 Effect of UA on p65 and phospho-p65 expressions of THP-1 cells induced

#Plt;0.05 compared with control group;*Plt;0.05 compared with LPS group圖5 不同濃度熊果酸對(duì)LPS 誘導(dǎo)的THP-1細(xì)胞NF-κB影響Fig 5 Effect of UA on the NF-κB activation of THP-1 cells induced by LPS(±s，n=3)

總之，THP-1細(xì)胞經(jīng)LPS作用后，LPS能通過細(xì)胞膜上的TLR4，活化NF-κB，進(jìn)而促進(jìn)炎性反應(yīng)因子MCP-1和IL-6的合成和釋放；而在UA干預(yù)后，相應(yīng)指標(biāo)會(huì)相對(duì)降低，說明UA可能是通過抑制TLR4-NF-κB通路而減輕LPS誘導(dǎo)的THP-1細(xì)胞損傷，這為臨床上預(yù)防和治療炎癥提供了一定的理論依據(jù)。

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Ursolic acid alleviated the LPS-induced damage in THP-1 cells

SUN Ai-ping, SUN Shu-ming, ZHANG Guo-jun, WANG Yan-hua, SONG Xiang-feng*

(Research Center for Immunology, Xinxiang Medical University, Xinxiang 453003,China)

ObjectiveTo investigate the alleviating effect and mechanism of ursolic acid against LPS-induced damage in THP-1 cells.MethodsTHP-1 cells were exposed to 10 μg/L LPS for 20 h, ursolic acid of different concentrations were added. Cell proliferation was tested by MTT, the expressions of TLR4,MCP-1 and IL-6 mRNA were detected by RT-PCR, enzyme-linked immunosorbent assay(ELISA) was applied to detect the production of monocyte chemoattractant protein1 (MCP-1) and interleukin-6 (IL-6), P65 and Phosphorylation-P65 were detected on protein level using Western blot, the nuclear transcription factor kappa B (NF-kappa B) activity was detected by luciferase report system.ResultsLPS group significantly increased MCP-1, TLR4, IL-6 mRNA and MCP-1, IL-6, P65, Phosphorylation-P65 proteins expression and enhanced NF-κB activity. Ursolic acid (1, 5 μmol/L) intervention groups significantly reduced MCP-1, TLR4, IL-6 mRNA expression and MCP-1, IL-6 proteins expression and inhibited NF-κB activity.ConclusionsUrsolic acid may alleviate LPS-induced damage of THP-1 cells by reducing the NF-κB activity.

ursolic acid;THP-1; TLR4;MCP-1; IL-6; NF-κB

2013-03-25

2013-06-27

新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院博士啟動(dòng)基金(BSQDJJ201208)

*通信作者(correspondingauthor)： xfsong@xxmu.edu.cn

1001-6325(2014)01-0088-05

R392.5

A