薛照靜，申 樂(lè)，王之遙，黃宇光

(中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)院 麻醉科，北京 100730)

研究論文

JAK2/STAT3通路參與大鼠坐骨神經(jīng)結(jié)扎神經(jīng)病理性疼痛模型

薛照靜，申 樂(lè)，王之遙，黃宇光*

(中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)院 麻醉科，北京 100730)

目的結(jié)扎大鼠雙側(cè)坐骨神經(jīng)復(fù)制bCCI模型，觀察JAK2/STAT3通路的激活情況。方法60只體質(zhì)量180～200 g SD雌性大鼠隨機(jī)分為3組, bCCI組，sham組及Na?ve組。分別于bCCI手術(shù)術(shù)前1 d，術(shù)后3、7、14和21 d取腰段脊髓背角，并進(jìn)行RT-PCR及Western blot觀察通路中主要因子的mRNA 水平及蛋白水平的變化。結(jié)果bCCI組大鼠對(duì)機(jī)械、熱刺激及冷丙酮刺激的痛覺(jué)閾值明顯降低。與sham組及Na?ve相比，bCCI組STAT3、SOCS3、JAK2及IL-6 mRNA水平顯著升高，且3組在不同時(shí)間點(diǎn)具有差異(Plt;0.05)。與sham組及Na?ve相比，bCCI組P-STAT3、JAK2和SOCS3蛋白水平升高。結(jié)論大鼠bCCI神經(jīng)病理性疼痛模型JAK2/STAT3通路激活。

JAK2；STAT3；神經(jīng)病理性疼痛

神經(jīng)病理性疼痛是由神經(jīng)系統(tǒng)原發(fā)性損害和功能障礙所激發(fā)或引起的疼痛，由于機(jī)制復(fù)雜，在臨床醫(yī)療中是一個(gè)巨大的挑戰(zhàn)。神經(jīng)系統(tǒng)與免疫系統(tǒng)之間的相互作用，為治療神經(jīng)病理性疼痛提供了新的靶點(diǎn)。JAK(janus kinase，JAK)/STAT(signal transducers and activators of transcription，STAT)信號(hào)通路是近年來(lái)發(fā)現(xiàn)的一條由細(xì)胞因子刺激的信號(hào)傳導(dǎo)通路，在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中，JAK2/STAT3通路在抑制炎性反應(yīng)、腫瘤[1]及神經(jīng)退行性變[2]、神經(jīng)病理性疼痛中發(fā)揮重要作用。目前的研究認(rèn)為，STAT分子家族，尤其是STAT3在免疫調(diào)節(jié)及應(yīng)激中占有重要作用。因此，通過(guò)對(duì)JAK/STAT通路在神經(jīng)病理性疼痛中的作用的研究，希望能了解神經(jīng)病理性疼痛的分子機(jī)制進(jìn)而為神經(jīng)病理性疼痛提供新的治療方案。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)及分組

SPF級(jí)SD雌性大鼠，180～200 g,室溫22 ℃左右,相對(duì)濕度50%左右,明暗各12 h，自由攝水和食物, 每日更換籠具和墊料。大鼠由北京動(dòng)物研究所 [許可證SCXK(京)：20022003] 提供，飼養(yǎng)于北京協(xié)和醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。適應(yīng)環(huán)境3～5 d后手術(shù)。

按照隨機(jī)數(shù)字表法將大鼠隨機(jī)分為bCCI組，sham組及Na?ve組(n=60)。bCCI組進(jìn)行雙側(cè)坐骨神經(jīng)結(jié)扎。腹腔注射戊巴比妥40～50 mg/kg，在距坐骨神經(jīng)起始處上方2 mm用4.0含鉻羊腸線結(jié)扎坐骨神經(jīng)4道，每道間隔約1 mm。間斷縫合；sham組進(jìn)行坐骨神經(jīng)暴露但不進(jìn)行手術(shù)結(jié)扎,其余同模型組；Na?ve組僅保證相同的飼養(yǎng)時(shí)期；手術(shù)由同一人操作。對(duì)側(cè)同樣。

1.2 動(dòng)物行為學(xué)方法

分別于bCCI模型手術(shù)前1 d，術(shù)后3、7、14和21 d進(jìn)行動(dòng)物行為學(xué)測(cè)量。測(cè)定間隔為3 min，每只左右后足重復(fù)測(cè)量3次，將3次讀數(shù)取平均值為痛閾值。

1.2.1 機(jī)械刺激誘發(fā)痛測(cè)定：采用電子von Frey測(cè)痛儀測(cè)定[3]。安靜的適應(yīng)環(huán)境10～30 min。用金屬探頭垂直刺激大鼠后腳底。記錄儀自動(dòng)記錄使大鼠產(chǎn)生縮足反射的最小刺激強(qiáng)度。3次平均值作為機(jī)械縮足反射閾值(mechanical withdrawal threshold，MWT)。

1.2.2 熱刺激誘發(fā)痛測(cè)定：采用BME-410A熱照射疼痛刺激儀測(cè)定。安靜的適應(yīng)環(huán)境10～30 min。用熱測(cè)痛儀照射大鼠左、右后腳底，待大鼠產(chǎn)生快速縮足、揚(yáng)足或添足后停止照射，記錄下照射持續(xù)時(shí)間即為縮足反射的潛伏期(paw withdrawal thermal latency，PWTL)。將3次讀數(shù)取平均值作為熱刺激傷害感受閾，最高閾值設(shè)為20 s。

1.2.3 冷刺激誘發(fā)痛測(cè)定[4]：大鼠適應(yīng)環(huán)境15 min分鐘后，將0.1 mL丙酮滴加在大鼠的后足上。記錄1 min內(nèi)大鼠出現(xiàn)抬足、縮足、快速甩足以及甩足后舔足等陽(yáng)性表現(xiàn)的次數(shù)，間隔3 min重復(fù)。每只后足重復(fù)3次。次數(shù)作為冷痛閾值(total number of withdrawal)。

1.2.4 處死動(dòng)物及取材：深度麻醉后斷頭處死大鼠。俯臥位，迅速暴露脊髓，小心取出腰膨大，切除脊髓背角，立即放入液氮冷卻5～10 min后放入-80 ℃冰箱保存。

1.3 RT-PCR(real time -PCR)

Trizol法進(jìn)行提取RNA。紫外分光光度儀測(cè)定RNA濃度與質(zhì)量鑒定。每個(gè)RNA樣本的OA260/OA280值要求在1.8～2.1之間則可以認(rèn)為RNA的純度較好，否則棄之不用。RT-PCR反應(yīng)采用TAKARA反轉(zhuǎn)錄及RT-PCR試劑盒。條件合格的RNA樣本按照PrimeScriptTMRT Master Mix(Takara DRR036A)說(shuō)明加入試劑行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)合成CDNA。RT-PCR選用GAPDH基因做為內(nèi)參，引物設(shè)計(jì)運(yùn)用Primer Premier5.0和Oligo 6軟件進(jìn)行引物設(shè)計(jì)， 各基因引物設(shè)計(jì)(表1)。cDNA模板按照SYBRPremix ExTaqTMII(Takara RR820A)說(shuō)明進(jìn)行RT-PCR反應(yīng)，每個(gè)樣品同時(shí)做3個(gè)復(fù)管。AB Applied Biosystems Step-one plus進(jìn)行RT-PCR反應(yīng)。PCR結(jié)束后根據(jù)熔解曲線確定產(chǎn)物的特異性并采用2-ΔΔCT法計(jì)算基因表達(dá)量。

表1 RT-PCR目的基因引物序列

1.4 Western blot

組織塊破碎后(冰上操作)，加RIPA(單去污劑)裂解液裂(含蛋白酶抑制劑及磷酸酶抑制劑)勻漿。使用BCA法，通過(guò)微孔酶標(biāo)儀制作標(biāo)準(zhǔn)曲線測(cè)定蛋白濃度。按照分子質(zhì)量大小選擇配8%或12%分離膠，取40 μg樣品上樣，用彩染蛋白分子量指示標(biāo)準(zhǔn)SDS-PAGE膠(10 cm×10 cm)。80 V電壓電泳直到跑出濃縮膠，120 V電壓直至蛋白指示劑移動(dòng)到膠的底部。300 mA恒流轉(zhuǎn)膜75 min，5%脫脂牛奶室溫封閉1 h。抗體(CST及Santa Cruze公司)。抗pSTAT3抗體(1∶500),抗STAT3抗體(Tyr705,1∶500),抗 SOCS3 抗體(1∶100),抗JAK2抗體(1∶500)4 ℃過(guò)夜。TBST清洗3遍，二抗孵育，輕度震蕩，室溫1 h。ImageQuant LAS 4000mini進(jìn)行儀器曝光。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 動(dòng)物行為學(xué)變化

各組術(shù)前及術(shù)后各時(shí)間點(diǎn)，左右側(cè)后足痛閾無(wú)差異，選擇左右平均值作為每個(gè)時(shí)間的閾值水平。Na?ve組與sham組相比，MWT，PMWT及對(duì)丙酮冷刺激在術(shù)前與術(shù)后各時(shí)間點(diǎn)無(wú)差異(圖1)。

2.1.1 大鼠機(jī)械刺激縮足反射閾值(MWT)的變化：術(shù)后第7天開(kāi)始至21天，bCCI組雙后足機(jī)械性痛閾較術(shù)前及正常對(duì)照組、假手術(shù)組顯著下降 (Plt;0.05)，并在術(shù)后第14天達(dá)到最低點(diǎn)。

2.1.2 大鼠熱反射閾值(PMWT)的變化：術(shù)后第7天開(kāi)始至21天，bCCI組左后足熱刺激傷害感受閾閾值較術(shù)前及正常對(duì)照組、假手術(shù)組顯著下降(Plt;0.05)，并在術(shù)后第14天達(dá)到最低點(diǎn)。

2.1.3 大鼠對(duì)冷丙酮刺激縮足反應(yīng)的變化：術(shù)后第7天起bCCI大鼠的陽(yáng)性反應(yīng)次數(shù)即顯著多于術(shù)前(Plt;0.05)。

2.2 RT-PCR結(jié)果(圖2)

2.2.1STAT3 mRNA：與sham組相比，在bCCI組STAT3 mRNA有明顯升高(Plt;0.05)，于第14天達(dá)到高峰；與Na?ve組相比，升高4.98倍(Plt;0.05)。

2.2.2SOCS3 mRNA：與sham組相比，bCCI組SOCS3 mRNA水平明顯升高(Plt;0.05)，與Na?ve組相比，升高10.8倍(Plt;0.05)。

2.2.3JAK2 mRNA:與sham組相比，bCCI組JAK2 mRNA于第14天顯著升高(Plt;0.05)；與Na?ve組相比，升高1.92倍(Plt;0.05)。

*Plt;0.05 compared with sham圖1 bCCI組、sham組及Na?ve組大鼠后足對(duì)不同刺激的行為學(xué)變化趨勢(shì)

*Plt;0.05 compared with sham圖2 目的基因SOCS3、STAT3、IL-6和JAK2 mRNA變化

2.2.4IL-6 mRNA：3 dIL-6 mRNA水平升高，之后下降，與sham組相比，至術(shù)后21 dIL-6 mRNA再次升高(Plt;0.05)；與Na?ve組相比，升高6.15倍(Plt;0.05)。

2.3 Western blot 結(jié)果(圖3)

2.3.1 P-STAT3：與sham組及Na?ve相比，bCCI組P-STAT3蛋白水平無(wú)顯著升高。

2.3.2 STAT3：與sham組及Na?ve相比，bCCI組STAT3蛋白水平無(wú)顯著變化。

2.3.3 JAK2：與sham組及Na?ve相比，bCCI組JAK2蛋白水平無(wú)明顯升高。

2.3.4 SOCS：與sham組及Na?ve相比，bCCI組SOCS3蛋白水平無(wú)明顯升高。

3 討論

本研究發(fā)現(xiàn)JAK2/STAT3 通路在大鼠bCCI神經(jīng)病理性疼痛模型中是激活的，與研究假設(shè)相符。

單側(cè)坐骨神經(jīng)結(jié)扎模型(uCCI)，大鼠術(shù)側(cè)重量與非手術(shù)側(cè)重量隨時(shí)間變化逐漸失衡，對(duì)刺激的敏感度出現(xiàn)差異，會(huì)造成結(jié)果的失真。bCCI則避免了這一誤差。各組各點(diǎn)左后足與右后足變化水平及趨勢(shì)基本一致。術(shù)后第7天開(kāi)始至21天，bCCI組雙后足痛閾較術(shù)前及sham組、Na?ve組顯著下降，并在術(shù)后第14天達(dá)到最低點(diǎn)。研究采用雌性、小質(zhì)量鼠是由于它們對(duì)疼痛更為敏感。

本研究發(fā)現(xiàn)在mRNA 水平及蛋白水平，JAK2及STAT3均出現(xiàn)升高，其中，JAK2于14 d有顯著升高，并且疼痛行為學(xué)相一致，表明大鼠bCCI中JAK2/STAT3通路激活，可能與神經(jīng)病理性疼痛的發(fā)生與維持相關(guān)。脊髓損傷模型后同樣發(fā)現(xiàn)STAT3的激活對(duì)軸突的再生起著促進(jìn)作用[5]。結(jié)扎脊神經(jīng)(SNL)后脊髓背角小膠質(zhì)細(xì)胞中的STAT3磷酸化[6]，脊髓束半橫斷損傷模型同樣發(fā)現(xiàn)JAK2及STAT3的激活[7]，說(shuō)明STAT3的激活在疼痛模型中發(fā)揮重要作用。但是其時(shí)間趨勢(shì)與本研究不同。這可能與單側(cè)模型，取材精確度可能受對(duì)側(cè)脊髓的干擾導(dǎo)致結(jié)果偏差相關(guān)。也可能與模型導(dǎo)致機(jī)體對(duì)刺激的反應(yīng)過(guò)程不同相關(guān)。

SOCS基因表達(dá)通常為陰性，受到刺激后快速合成， SOCS蛋白結(jié)合磷酸化JAK，抑制下游通路的激活，參與JAK/STAT通路的負(fù)反饋調(diào)節(jié)。本研究發(fā)現(xiàn)，bCCI組SOCS3 mRNA明顯升高。SOCS3蛋白表達(dá)先上升后下降，這可能由于手術(shù)急性損傷導(dǎo)致，之后通路出現(xiàn)負(fù)反饋，使蛋白的表達(dá)出現(xiàn)下降。SNL模型同樣發(fā)現(xiàn)L5～L6脊髓背根神經(jīng)節(jié)會(huì)激活SOCS3 mRNA的表達(dá)[6]。

圖3 SOCS3、STAT3、P-STAT3和JAK2 mRNA的Western blot結(jié)果

本研究發(fā)現(xiàn)IL-6 mRNA先升高，后下降，于21 dIL-6 mRNA顯著升高。這可能與bCCI大鼠行為學(xué)表現(xiàn)在14 d疼痛達(dá)到高峰，機(jī)體會(huì)產(chǎn)生二次應(yīng)激，從而導(dǎo)致IL-6在21 d再次升高有關(guān)。大鼠CCI模型L4～L5脊髓背角神經(jīng)元IL-6激活[8]， SNL后L5～L6脊髓背根神經(jīng)節(jié)IL-6 mRNA表達(dá)同樣明顯升高[6]。

近年來(lái)，銀杏肉堿B[9]和雷公藤[10]發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用均由JAK2/STAT3通路介導(dǎo)的，提示JAK2/STAT3通路抑制劑可能在治療神經(jīng)病理性疼痛中有一定的潛力。因此，下一步將嘗試探求JAK2/STAT3抑制劑對(duì)神經(jīng)病理性疼痛的影響。對(duì)JAK/STAT信號(hào)通路的進(jìn)一步認(rèn)識(shí)，如STAT1[11]，也可為神經(jīng)病理性疼痛的有效治療提供新靶點(diǎn)。

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JAK2/STAT3 pathway is involvedin bilateral chronic constriction injury rat neuropathic pain model

XUE Zhao-jing, SHEN Le，WANG Zhi-yao, HUANG Yu-guang*

(Dept. of Anesthesiology, PUMC Hospital, CAMS amp; PUMC，Beijing 100730，China)

ObjectiveTo evaluate the contribution of the JAK2/STAT3 pathway to neuropathic pain by animal model.MethodsA rat model of bCCI was established and 60 rats’ behavior tests were performed on the day before surgery and on day 3,7,4 and 21 after surgery, L4～L6 dorsal spinal cord was harvested at the each time point. RT-PCR and Western blot were performed to explore the activation of JAK2/STAT3 pathway.ResultsPain-related behavioral tests socres in the bCCI rats were significant decreased as compared to the sham-operated and na?ve group at each time point postoperatively (Plt;0.05).SOCS3 mRNA andSTAT3 mRNA significantly increased on day 14, accompanied byJAK2 mRNA of with a similar time course.IL-6 mRNA level increased on day 3 and showed statistically significant increases on day 21. Western blot analysis showed that JAK2, P-STAT3, SOCS3 increased at different timepoints.ConclusionOur results suggest that the JAK2/STAT3 pathway in the spinal dorsal horn was significantly upregulated in a rat bCCI model of neuropathic pain which will open new avenues for therapeutic intervention.

JAK2；STAT3；neurpathic pain

2013-10-08

2013-11-14

國(guó)家自然科學(xué)基金 (31070930)；國(guó)家自然科學(xué)基金青年課題(81200869)

*通信作者(correspondingauthor): garybeijing@163.com

1001-6325(2014)01-0062-06

R 164

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