楊 波，梁清華*，熊新貴，陳 疆，蕭梅芳

（1.中南大學湘雅醫(yī)院中西醫(yī)結合研究所，湖南 長沙410008；2.中南大學湘雅醫(yī)院遠程醫(yī)療中心，湖南 長沙410008；3.中南大學湘雅醫(yī)院健康管理中心，湖南 長沙410008）

高血壓病腦出血是臨床常見急癥， 病殘率及病死率均較高。 腦出血屬于中醫(yī)學“中風病”的范疇，肝陽化風證多見于中風病的急性期， 陰虛風動證多見于中風病恢復期或后遺癥期[1]。 課題組前期運用蛋白質組學方法對高血壓腦出血肝陽上亢證、 肝陽化風證血清[2]與外周血單個核細胞[3]進行了研究，發(fā)現(xiàn)高血壓病肝陽上亢證與肝陽化風證具有相同和差異表達的蛋白質， 提示高血壓病肝陽上亢證和肝陽化風證有共同的物質基礎和不同的本質內(nèi)涵。 我們運用比較蛋白質組學方法動態(tài)觀察高血壓腦出血患者急性期肝陽化風證、 恢復期陰虛風動證外周血單個核細胞的蛋白質表達變化， 以期從蛋白質組學角度進一步探討“肝陽化風證”的本質內(nèi)涵。

1 臨床資料與方法

1.1 臨床資料

1.1.1 診斷標準 西醫(yī)診斷標準符合《中國腦血管病防治指南（2005年）》(制定的腦出血診斷標準[4]，分期標準符合2000年全國腦血管專題研討會對腦卒中的分期標準[5]，均經(jīng)過顱腦CT 證實為腦實質出血(出血部位為基底節(jié)，出血量為30 mL 以內(nèi))，基礎病為高血壓病(高血壓3 級)所致腦出血。 肝陽化風證、陰虛風動證辨證標準參考《中醫(yī)肝臟象現(xiàn)代研究與臨床》[6]，經(jīng)兩位以上高級職稱醫(yī)師辨證評分。

1.1.2 納入和排除標準 納入標準：(1)符合西醫(yī)疾病診斷標準、中醫(yī)辨證標準及主癥辨證5 級計分標準；(2)征得患者家屬同意；(3)經(jīng)過醫(yī)院倫理委員會批準；(4)年齡19～69 歲。 排除標準：排除小腦、腦干出血，腦外傷致出血，使用抗凝劑致腦出血，腫瘤/腦血管畸形致腦出血， 混合性中風或出血性梗死，合并嚴重心、肝、腎功能不全、糖尿病、嚴重感染者[7]。

1.1.3 一般資料 10 例高血壓病腦出血患者來自2009年6月～2009年10月中南大學湘雅醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科住院病人，其中男8 例，女2 例，年齡45～67 歲。起病3 d 內(nèi)辨證為肝陽化風證（簡稱肝陽化風證組），追蹤觀察發(fā)病后3月內(nèi)辨證為陰虛風動證（簡稱陰虛風動證組）。全部患者入院后予降低顱內(nèi)壓、降血壓（有效控制血壓140/90 mm Hg）、控制血糖、護腦、營養(yǎng)神經(jīng)、預防感染及應激性潰瘍等相關內(nèi)科保守治療，全部病人未給予相關證型的中藥處方口服。 另設10 例健康志愿者（簡稱健康對照組），來自湘雅醫(yī)院健康管理中心，經(jīng)體檢符合老齡健康人條件者(參照1982年2月中華醫(yī)學老年醫(yī)學會規(guī)定)，男性7 例，女性3 例，年齡44～68 歲，其年齡、性別均與病例組相匹配(P＞0.05)，排除心、肝、腎等功能不全者，有活動性胃腸病變者，血液、內(nèi)分泌系統(tǒng)疾病者及過敏體質者。

1.2 主要試劑[6]

固相pH 梯度干膠條、IPG 緩沖液、 兩性電解質、覆蓋液、低分子量標準蛋白質、尿素、丙烯酰胺、甲叉雙丙烯酰胺、 甘氨酸、Tris、CHAPS、SDS、Amersham 2-D QuantKit 均為Amersham Bioscieces 公司產(chǎn)品；二硫蘇糖醇(DTT)、碘乙酰胺、雙向凝膠電泳標準蛋白質、碳酸氫銨、三氟乙酸、乙腈、基質a-氰基-4-羥基肉桂酸、TEMED 均為Sigma 公司產(chǎn)品， 考馬斯亮藍G-250 為USB 公司產(chǎn)品；Trizol 為Invitrogen公司產(chǎn)品；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.3 實驗方法

實驗均在中南大學湘雅醫(yī)院衛(wèi)生部腫瘤蛋白質組學重點實驗室完成。

1.3.1 淋巴細胞分離 高血壓腦出血患者于起病3 d （辨證為肝陽化風證） 與追蹤觀察發(fā)病后3月（辨證為陰虛風動證）分別抽取靜脈血，同時抽取對照組靜脈血，參照文獻[8]方法分離外周血淋巴細胞而獲得單個核細胞，于-70 ℃低溫凍干保存。

1.3.2 蛋白質提取及濃度測定 參考文獻[3]方法稱50～60 mg 淋巴細胞加入80 μL 細胞裂解液，混合液氮反復研磨， 震蕩使之充分溶解， 渦旋混勻，12 000 r/min 4 ℃離心1 h，取上清液即為細胞總蛋白質。用bradford 法BCA 蛋白質定量試劑盒測定蛋白質濃度[9]，其余上清液分裝置-70 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.3.3 雙向凝膠電泳（2-DE）[10]固相pH 梯度雙向凝膠電泳： 主要按IPGphor 等電聚焦系統(tǒng)指南進行(IPGphor 等 電 聚 焦 儀，Amersham Pharmacia 公 司)。各組上樣量均為1 mg。所得凝膠用考馬斯亮藍法染色，加入脫色液(20%乙醇)至背景完全脫色。

1.3.4 凝膠圖像分析 用Imagescanner 掃描儀(Bio-Rad 公司)掃描考染的凝膠，采用PDQuest 8.0軟件(Bio-Rad 公司)進行詳細分析，比較蛋白斑點的差異[11]。差異點的判斷有兩個標準：一是有和無的差別，二是灰度值差異比率小于0.5 或大于200%為差異點，差異蛋白至少出現(xiàn)在3 次不同的實驗中。

1.3.5 差異表達蛋白的質譜分析 切下差異表達的蛋白質點，進行脫色，膠內(nèi)酶解，測定肽質量指紋圖譜(PMF)，將PMF 用Mascot Distiller 軟件(Matrix science)識別單同位素峰，獲得的肽端的質荷比(m/z)數(shù) 值 輸 入Mascot 軟 件(Matrixscience，www.matrixscience.com) 檢索NCBI、SwissProt 蛋白質數(shù)據(jù)庫進行蛋白鑒定。

1.4 統(tǒng)計學分析

2 結果

2.1 腦出血肝陽化風證與陰虛風動證外周血單個核細胞差異蛋白質點的比較

高血壓腦出血急性期肝陽化風證與恢復期陰虛風動證患者分別取靜脈血提取單個核細胞總蛋白，與健康人比較，進行雙向凝膠電泳，每組檢測3次，重復性好，獲得比較清晰的雙向電泳圖譜，結果如圖1 所示，見封三彩圖。應用PDQuest 8.0 軟件進行分析，檢測到肝陽化風證組與陰虛風動證組之間存在3個差異表達蛋白，提示這三個蛋白可能與腦出血不同時期證型變化有關。

2.2 腦出血肝陽化風證與陰虛風動證外周血單個核細胞差異蛋白質的質譜鑒定

對差異表達蛋白進行MALDI-TOF-MS 質譜分析， 通過Mascot 軟件檢索NCBI、SwissProt 數(shù)據(jù)庫，初步鑒定了這3個蛋白，分別為肌動蛋白、假想蛋白片段、纖維蛋白原α 鏈前體。 其中肌動蛋白在腦出血肝陽化風證組、陰虛風動證組均較對照組表達下調，而在陰虛風動證組又較肝陽化風證組表達下調；纖維蛋白原α 鏈前體在腦出血肝陽化風證組表達上調，在陰虛風動證組表達下調。 表明這兩個差異蛋白可能與腦出血肝陽化風證、陰虛風證動的發(fā)生發(fā)展密切相關。 假想蛋白在肝陽化風證組表達缺失，在陰虛風動證組表達上調，提示假想蛋白可能與陰虛風動證發(fā)展有關。 各差異蛋白在各組的表達變化趨勢見表1。

表1 高血壓腦出血患者肝陽化風證組、陰虛風動證組及健康對照組外周血單個核細胞差異蛋白質表達鑒定

3 討論

課題組前期以肝陽化風證為中心， 從同病異證、異病同證、相關證、同類證等角度闡述了肝陽化風證蛋白質表達的關聯(lián)性與差異性及肝風內(nèi)動3個亞型相同表達的蛋白，初步獲得了肝陽化風證蛋白質的表達譜及功能，為證本質的進一步研究奠定了基礎[11]。本實驗采用比較蛋白質組學方法，病證結合， 動態(tài)研究同一患者腦出血急性期肝陽化風證、恢復期陰虛風動證的蛋白質表達差異，是從另一角度排除“?。ǜ哐獕耗X出血）”的干擾，更好地進行證（肝陽化風證、陰虛風動證）本質內(nèi)涵的研究。 結果發(fā)現(xiàn)，高血壓腦出血患者，急性期肝陽化風證與恢復期陰虛風動證分別抽取靜脈血提取單個核細胞總蛋白，進行雙向凝膠電泳，獲得了比較清晰的雙向電泳圖譜，采用PDQuest 分析并經(jīng)質譜初步鑒定，腦出血急性期肝陽化風證與恢復期陰虛風動證之間存在3個差異蛋白，其中肌動蛋白與纖維蛋白原α 鏈前體兩個蛋白可能與腦出血肝陽化風證、 陰虛風動證的發(fā)生發(fā)展密切相關，再一次表明中醫(yī)證有其相對獨特的物質基礎。

研究表明腦出血急性期存在血小板活化現(xiàn)象， 活化的血小板可能參與了血腫周圍腦水腫的形成[12]。 血小板活化的分子基礎是細胞內(nèi)骨架蛋白的變化，肌動蛋白是細胞骨架的組成部分，本研究發(fā)現(xiàn)肌動蛋白在腦出血肝陽化風證、陰虛風動證下調，且陰虛風動證較肝陽化風證下調更明顯，從另一方面提示肌動蛋白表達水平可能和血小板的早期活化有關。

纖維蛋白原 （fibrinogen，F(xiàn)ib） 是纖維蛋白的前體，由兩對α 鏈、β 鏈及γ 鏈組成，既是急性時相蛋白參與炎癥反應，又作為體內(nèi)重要的凝血物質參與凝血過程，在動脈粥樣硬化及生理止血中發(fā)揮重要作用[13]。 研究表明Fib 與出血性腦卒中尤其是顱內(nèi)分支小動脈硬化后所致腦實質出血呈正相關[14]。 本研究發(fā)現(xiàn)腦出血急性期肝陽化風證組Fib 水平較健康對照組明顯升高，差異有顯著性（P＜0.05），恢復期陰虛風動證較健康對照組下降， 差異具有顯著性（P＜0.05）， 提示高Fib 水平與腦出血密切相關，且Fib 水平可能與出血性中風的病程有關。 因此推測Fib 可作為腦出血急性期肝陽化風證、 恢復期陰虛風動證的特異性蛋白。

腦血管病的發(fā)病基礎是動脈粥樣硬化。 腦出血急性期肝陽化風證為肝陽亢逆無制而表現(xiàn)動風的證候， 可能與細胞炎癥介質反應強烈緊密關聯(lián)，其中與炎性介質反應引起C 反應蛋白高水平表達、血管細胞黏附分子參與啟動的動脈粥樣硬化斑塊有關聯(lián)；陰虛風動證是陰液虧虛、筋脈失于濡養(yǎng)引動肝風的證候，多為疾病恢復期，病情相對穩(wěn)定，炎性介質反應不強，故指標顯示的異常變化較小。

肝陽化風證與陰虛風動證屬于高血壓腦出血同一患者， 兩者必定存在著某些相同的物質基礎，但由于處在不同的病變階段(有證的不同)表現(xiàn)為不同的證候，這些不同的證候是由不同的蛋白質功能來體現(xiàn)的，由此可見，證與病有相同的物質基礎，但更重要的是證本身具有物質基礎(差異的蛋白質表達)，為進一步尋找證的本質奠定了基礎。 然而由于病證的相對復雜性，臨床獲取樣本量較少，盡管通過質譜分析和數(shù)據(jù)庫查詢，所獲得的也只是部分蛋白質粗略的功能信息，因此，仍需要進一步擴大臨床樣本量，進一步探討差異蛋白質的功能研究及相關驗證工作。

[1]李家邦，李 瑛，熊國良，等.肝陽化風證病理生理學基礎的進一步研究[J].湖南醫(yī)科大學學報，2000，25(4)：343-346.

[2]熊新貴，梁清華，侯俊良，等.高血壓腦出血肝陽化風證與肝陽上亢證患者血清蛋白質組學研究 [J]. 實用預防醫(yī)學，2007，14(6)：1 649-1 652.

[3]蕭梅芳，梁清華，熊新貴，等.高血壓腦出血肝陽化風證患者外周血單個核細胞的蛋白質組學研究[J].實用預防醫(yī)學，2008，15(3)：623-627.

[4]饒明俐.《中國腦血管病防治指南》摘要(四)[J].中風與神經(jīng)疾病雜志，2006，23(3)：132.

[5]黃如訓，郭玉璞.2000年廣州全國腦血管病專題研討會腦卒中的分型分期治療 （建議草案）[J]. 中國神經(jīng)精神疾病雜志，2001，27(1)：73-74.

[6]金益強.中醫(yī)肝臟象現(xiàn)代研究與臨床[M].北京：人民衛(wèi)生出版社，2000：238-241.

[7]蕭梅芳.高血壓病肝陽上亢證與高血壓腦出血肝陽化風證的蛋白質組學研究[D].長沙：中南大學碩士論文，2008.

[8]曾年菊，梁清華，陳 疆，等.腦梗死肝陽化風證患者外周血淋巴細胞凝膠圖譜分析[J].實用預防醫(yī)學，2007，14(6)：1 652-1 655.

[9]Bradford MM.A rapid and sensitive method for the quantitation of crogram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding [J]. Anal Biochem，1976（72）：248-254.

[10]陳 疆，張 揚，熊新貴，等.大定風珠治療腦出血恢復期陰虛動風證證效關系的蛋白質組學研究[J]. 湖南中醫(yī)藥大學學報，2013，33(11)：57-62.

[11]熊新貴，陳 疆，梁清華，等.中醫(yī)肝陽化風證本質蛋白質組學研究[J].中國中西醫(yī)結合雜志，2011，31(7)：913-920.

[12]林 杰，張國華，史福平，等.腦出血急性期血小板活化的臨床意義[J].臨床神經(jīng)病學雜志，2006，19(5)：355-387.

[13]瞿 萍，黃 輝，張 瓊，等.缺血性腦血管疾病患者血漿纖維蛋白原水平與頸動脈粥樣硬化[J]. 中華神經(jīng)科雜志，2008，41(6)：367-370.

[14]Chuang SY，Bai CH，Chen WH，et al. Fibrinogen independently Predicts the development of ischemic stroke in a Taiwanese population：CVDFACTS study [J]. Stroke，2009 （40）：1 578-1 584.