胡楊，秦文，廉凱

脊髓損傷包含脊髓組織原發(fā)性損傷和一系列代謝障礙所致的繼發(fā)性損傷，其治療一直是困擾醫(yī)學(xué)界的難題。而脊髓損傷后相應(yīng)神經(jīng)元的存活與否是脊髓損傷的重要預(yù)后因素之一。近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)促紅細(xì)胞生成素(erythropoietin,EPO)及其受體在神經(jīng)元和星形膠質(zhì)細(xì)胞均有表達(dá)，在中樞神經(jīng)系統(tǒng)缺氧/缺血性腦損傷和神經(jīng)元細(xì)胞中發(fā)揮抗凋亡、抗自由基及抗氧化作用，是一種重要的神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)建立原代培養(yǎng)的大鼠脊髓神經(jīng)元缺氧模型，觀察不同濃度EPO對(duì)缺氧神經(jīng)元的保護(hù)作用。

1 材料和方法

1.1 動(dòng)物

新生(出生后3 d)Wistar大鼠(湖北文理學(xué)院醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供)，分離脊髓運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元做原代培養(yǎng)。

1.2 試劑和儀器

EPO(沈陽(yáng)三生制藥)；高糖型DMEM培養(yǎng)基(美國(guó)GIBCO公司)；1%胎牛血清(hyclone,USA)；多聚賴氨酸(poly-L-lysine,PLL)、胰蛋白酶、膠原酶(凌飛公司)；兔抗鼠神經(jīng)元特異性烯醇化酶(neuron specific enolase,NSE)、SABC免疫組織化學(xué)試劑盒(博士德公司)；噻唑藍(lán)(thiazolyl tetrazolium,MTT；上海伯奧生物技術(shù)有限公司)；乳酸鹽脫氫酶(lactate dehydrogenase,LDH)試劑盒(南京建成生物工程研究所)；紅細(xì)胞生成素受體(EPOR)兔抗鼠多克隆抗體；SP9001免疫組化試劑盒、DAB試劑盒(北京中山生物技術(shù)有限公司)；倒置相差顯微鏡(inverted phase contrast microscope,IPCM)(Olympus 1×70/1×50,Japan)；CO2培養(yǎng)箱(SHELLLAB,TC2323,USA)；722型分光光度計(jì)。

1.3 脊髓神經(jīng)元的原代培養(yǎng)及鑒定

出生3 d的Wistar大鼠，無(wú)菌條件下分離出脊髓，切取脊髓的腹側(cè)組織，置于0.25%胰蛋白酶和1%膠原酶中，37℃消化30 min。D2Hanks液沖洗2遍，加入DMEM與胎牛血清(4∶1)終止消化，吹打成單細(xì)胞懸液，過(guò)200目不銹鋼濾網(wǎng)。以1×106/ml的細(xì)胞密度接種于涂有多聚賴氨酸的96孔培養(yǎng)板中，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。以后每3天換液1次，接種后3 d加入5μg/ml阿糖胞苷抑制非神經(jīng)細(xì)胞生長(zhǎng)。取培養(yǎng)10 d的細(xì)胞進(jìn)行NSE免疫組織化學(xué)染色，4%多聚甲醛室溫固定；加入0.3%H2O2甲醇，以去除內(nèi)源性過(guò)氧化氫酶；10%綿羊血清封閉20 min；加入一抗(1∶200兔抗鼠NSE抗體)4℃冰箱過(guò)夜；二抗(1∶200生物素化的山羊抗兔)孵育60 min；ABC液60 min；DAB顯色，酒精脫水，二甲苯透明，樹(shù)膠封片。

1.4 缺氧模型的建立及實(shí)驗(yàn)分組

取培養(yǎng)10 d的脊髓運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元，隨機(jī)分為正常對(duì)照組、缺氧8 h后復(fù)氧24 h組(缺氧組)、EPO組。正常對(duì)照組神經(jīng)細(xì)胞置于36℃，含90%空氣、10%CO2的培養(yǎng)箱內(nèi)進(jìn)行培養(yǎng)。EPO組在缺氧前24 h加入EPO，終濃度為20 kU/L、60 kU/L、100 kU/L。然后將缺氧組和EPO組細(xì)胞同時(shí)移至缺氧培養(yǎng)箱內(nèi)，連續(xù)充以無(wú)氧氣體(95%N2、5%CO2)，缺氧條件下分別培養(yǎng)8 h后置于常氧下繼續(xù)培養(yǎng)24 h。

1.5 形態(tài)學(xué)觀察及神經(jīng)元存活率測(cè)定

倒置顯微鏡下觀察神經(jīng)元的生長(zhǎng)狀態(tài)及形態(tài)變化。各組細(xì)胞加入100μmol/L DMEM培養(yǎng)液，每孔加入10 mg/ml MTT 10μl于培養(yǎng)液中，37℃孵育4 h，棄培養(yǎng)液，加入二甲基亞砜(DMSO)50μl/孔，振搖10 min，在酶標(biāo)儀下測(cè)量吸光度A值，測(cè)定波長(zhǎng)為570 nm。

1.6 LDH釋放率測(cè)定

分別取0.194 mg/ml丙酮酸鈉和0.154 mg/ml還原型輔酶(NADH)各1.3 ml，溶于pH 7.5的K2HPO4/KH2PO4緩沖液，加入0.4 ml待測(cè)培養(yǎng)液，37℃下迅速混勻，30 s鐘后每隔10 s用微孔酶標(biāo)儀在340 nm處測(cè)定光密度(OD)值，連續(xù)5 min，以每毫升培養(yǎng)液每分鐘OD值下降0.001為一個(gè)LDH活性單位。

1.7 RT-PCR檢測(cè)EPOR的表達(dá)

取各組蛋白樣品100 mg與等體積緩沖液混合，煮沸10 min，經(jīng)10%十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分離蛋白質(zhì)，轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上，2%脫脂奶粉封閉1 h，分別加入一抗，孵育過(guò)夜，洗膜3次。加入辣根過(guò)氧化酶標(biāo)記的二抗，37℃孵育1 h，TBST洗膜3次后，ECL發(fā)光系統(tǒng)顯影定影。同法顯示β-actin條帶。以同一樣品中各目的蛋白OD值/β-actin OD值的比值作為檢測(cè)蛋白的相對(duì)含量。用Image-Pro Plus6.0軟件進(jìn)行圖像分析。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

所有數(shù)據(jù)采用SPSS 13.0軟件包處理。組間差異采用方差分析，顯著性水平α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 形態(tài)學(xué)觀察

正常對(duì)照組脊髓運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元培養(yǎng)10 d后，神經(jīng)元相互之間、神經(jīng)元和非神經(jīng)元細(xì)胞(主要是星形膠質(zhì)細(xì)胞)之間相互形成聯(lián)系，連接成密集的網(wǎng)絡(luò)(圖1A)。缺氧組缺糖損傷后的細(xì)胞完全失去光澤，光暈消失，透光率下降，突起斷裂收縮，胞體皺縮成球形，網(wǎng)絡(luò)消失，不少細(xì)胞破裂死亡，并出現(xiàn)懸浮死細(xì)胞(圖1B)。而EPO組大部分細(xì)胞仍保持原有形態(tài)學(xué)特征，胞膜完整，胞周光暈明顯，較多細(xì)胞突起尚存，少量神經(jīng)元細(xì)胞出現(xiàn)輕度腫脹(圖1C)，各種濃度均能明顯改善細(xì)胞缺氧性損傷的形態(tài)學(xué)變化。

圖1 倒置顯微鏡下觀察神經(jīng)元的生長(zhǎng)狀態(tài)(200×)

2.2 神經(jīng)元細(xì)胞存活率

5組細(xì)胞在缺氧前的存活率無(wú)顯著性差異(P>0.05)。正常對(duì)照組在常氧條件下培養(yǎng)的細(xì)胞存活率無(wú)明顯變化。與正常對(duì)照組比較，缺氧組和EPO組在缺氧并復(fù)氧后，脊髓運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元細(xì)胞的存活率均顯著下降(P<0.001)。EPO組的神經(jīng)元細(xì)胞存活率在復(fù)氧24 h時(shí)均明顯高于缺氧組(P<0.01)，且隨著濃度增加，存活率也提高。見(jiàn)表1。

表1 不同劑量EPO對(duì)缺氧神經(jīng)元細(xì)胞存活率的影響(%)

2.3 培養(yǎng)液中LDH滲出濃度

5組培養(yǎng)液中LDH含量在缺氧前無(wú)顯著性差異(P>0.05)。正常對(duì)照組各時(shí)相點(diǎn)的上清液中LDH含量基本一致。與正常對(duì)照組比較，缺氧組和EPO組在缺氧復(fù)氧后，培養(yǎng)液中LDH含量顯著增高(P<0.001)。EPO組LDH含量明顯低于缺氧組(P<0.01)，且隨著濃度的增加，LDH含量降低。見(jiàn)表2。

表2 不同劑量EPO對(duì)LDH滲出濃度的影響(U/L)

2.4 EPOR蛋白的表達(dá)

正常對(duì)照組在各時(shí)相點(diǎn)EPOR蛋白均有微量表達(dá)。缺氧8 h后缺氧組及EPO組EPOR蛋白表達(dá)明顯高于正常對(duì)照組(P<0.01)，至復(fù)氧24 h仍維持在高表達(dá)水平(P<0.001)，EPO組EPOR蛋白表達(dá)水平低于缺氧組(P<0.05)。見(jiàn)表3、圖2。

表3 各組EPOR表達(dá)

圖2 Western blotting檢測(cè)EPOR蛋白表達(dá)量

3 討論

隨著缺血缺氧性脊髓損傷分子機(jī)制研究的深入，神經(jīng)保護(hù)劑的研究已成為新的著眼點(diǎn)。EPO是一種糖蛋白激素，分子量約34 kD。傳統(tǒng)上認(rèn)為EPO是一種血細(xì)胞因子，在臨床上作為一種治療貧血的制劑而被廣泛使用[1]。然而近年來(lái)許多研究表明，EPO在中樞以及周圍神經(jīng)系統(tǒng)中均有廣泛表達(dá)，具有調(diào)節(jié)中樞神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育、神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)及神經(jīng)保護(hù)作用[2-3]。免疫組化結(jié)果顯示，EPO及EPOR在大腦主要分布于海馬及大腦皮質(zhì)中的神經(jīng)元和膠質(zhì)細(xì)胞中，脊髓組織中主要分布于前角運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元和帶髓鞘的軸突中。當(dāng)人和大鼠的大腦在缺血或缺氧時(shí)，EPOR表達(dá)顯著上調(diào)，發(fā)揮內(nèi)源性神經(jīng)保護(hù)作用。EPO在脊髓損傷中發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用的機(jī)制主要有以下幾點(diǎn)。

3.1 EPO介導(dǎo)EPOR的胞內(nèi)細(xì)胞傳導(dǎo)機(jī)制

EPO與EPOR結(jié)合使受體形成二聚體，JAK2發(fā)生自磷酸化反應(yīng)和受體活化，從而引發(fā)下游信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過(guò)程，包括Ras-MAPK、PI3K和STST5等酸磷酸化而相繼被激活。其中某些信號(hào)被轉(zhuǎn)導(dǎo)到核內(nèi)以調(diào)節(jié)抗凋亡基因的轉(zhuǎn)錄，抑制凋亡[4]。

3.2 改善損傷組織局部的血流與氧供

Squadrito的研究表明，EPO的血管保護(hù)作用與EPO調(diào)節(jié)誘導(dǎo)性NOS的活性有關(guān)[5]。而EPO對(duì)脊髓微循環(huán)的調(diào)節(jié)作用也可能是通過(guò)減少NO的合成實(shí)現(xiàn)的[6]。

3.3 抗氧化作用

Kaptanoglu等的研究表明，EPO能減少大鼠脊髓損傷后脂質(zhì)過(guò)氧化，減小脊髓損傷程度[7]。

3.4 神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)及促進(jìn)神經(jīng)生長(zhǎng)作用

在神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育過(guò)程中，EPOR在胚胎的胚性細(xì)胞區(qū)表達(dá)，直到成年始終產(chǎn)生神經(jīng)元。

3.5 抑制繼發(fā)性炎癥反應(yīng)

Ning等的研究表明，EPO不僅能明顯提高大鼠脊髓損傷后下肢運(yùn)動(dòng)功能，還能顯著減輕脊髓的炎性反應(yīng)，減少脊髓空洞的形成[8]。

本課題組之前通過(guò)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明，蛛網(wǎng)膜下腔給予EPO治療大鼠脊髓損傷，神經(jīng)功能恢復(fù)要顯著優(yōu)于靜脈給藥組及腹腔給藥組，推測(cè)原因可能是由于經(jīng)蛛網(wǎng)膜下腔給藥可迅速提高損傷局部EPO濃度，EPO與EPOR結(jié)合后啟動(dòng)一系列信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)調(diào)節(jié)抗凋亡基因的轉(zhuǎn)錄，抑制凋亡，從而發(fā)揮其最大的脊髓保護(hù)效應(yīng)[9]。此次經(jīng)體外培養(yǎng)大鼠脊髓運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元，給予適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)條件抑制非神經(jīng)細(xì)胞生長(zhǎng)，通過(guò)建立缺血缺氧損傷模型引起神經(jīng)元損害，與臨床脊髓損傷后繼發(fā)性病理?yè)p害造成的脊髓組織缺血缺氧病理過(guò)程類似，從細(xì)胞形態(tài)學(xué)、LDH釋放率以及EPOR表達(dá)指標(biāo)上觀察EPO對(duì)體外原代培養(yǎng)大鼠脊髓前角運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元缺氧損傷保護(hù)作用。結(jié)果表明，缺氧后神經(jīng)元細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)出現(xiàn)損傷性改變，LDH的釋放明顯增加，神經(jīng)元細(xì)胞EPOR呈大量強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)，EPO組EPOR表達(dá)要弱于缺氧組。因此，我們認(rèn)為缺血缺氧后神經(jīng)元細(xì)胞上的EPOR表達(dá)增加，給予外源性EPO預(yù)處理與EPOR結(jié)合后能激活信號(hào)傳導(dǎo)調(diào)節(jié)抗凋亡機(jī)制，有效抑制脊髓神經(jīng)元LDH釋放，減少神經(jīng)細(xì)胞的凋亡，且具有濃度依賴性，對(duì)神經(jīng)元的缺氧損傷具有保護(hù)作用。

盡管迄今為止尚未發(fā)現(xiàn)臨床證實(shí)有效的神經(jīng)保護(hù)劑，但神經(jīng)保護(hù)治療一直是研究的熱點(diǎn)。我們的實(shí)驗(yàn)表明，EPO對(duì)大鼠脊髓神經(jīng)元缺血缺氧具有神經(jīng)保護(hù)和神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)作用，EPO能被用來(lái)安全地治療脊髓損傷性疾病。雖然其作用機(jī)制尚未完全闡明，但這些實(shí)驗(yàn)結(jié)果給臨床神經(jīng)保護(hù)治療提供了一個(gè)新的選擇。

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