郭心磊，孫芳玲，艾厚喜，張麗，王文，安宜

缺血性腦卒中是一種導(dǎo)致嚴(yán)重永久性殘疾的神經(jīng)損傷，其治療是當(dāng)今醫(yī)學(xué)最重大的挑戰(zhàn)之一。傳統(tǒng)的研究思路是促進(jìn)中樞神經(jīng)細(xì)胞的軸突再生，穿過(guò)損傷位點(diǎn)與靶標(biāo)細(xì)胞重新建立連接。但是損傷后神經(jīng)細(xì)胞恢復(fù)非常有限，成為腦卒中預(yù)后的一大障礙。近年來(lái)，國(guó)際上提出的“神經(jīng)血管單元”[1]學(xué)說(shuō)受到廣泛的關(guān)注，血管新生為神經(jīng)前體細(xì)胞增殖和分化提供了適宜的微環(huán)境。并且腦室管膜下區(qū)神經(jīng)前體細(xì)胞能夠在血管新生過(guò)程分泌的趨化因子導(dǎo)向下向著損傷區(qū)域遷移，且遷移后的神經(jīng)前體細(xì)胞沿著新生的血管分布。

Ephrins是酪氨酸激酶超家族受體Ephs的配體，在多種生理過(guò)程中具有廣泛的作用。其中EphrinB2表達(dá)于動(dòng)、靜脈和毛細(xì)血管的內(nèi)皮細(xì)胞和神經(jīng)細(xì)胞中，在神經(jīng)、血管發(fā)育過(guò)程中具有重要作用[2-4]。敲除EphrinB2會(huì)造成胚胎小鼠心血管系統(tǒng)的嚴(yán)重畸形而導(dǎo)致死亡[5]。有實(shí)驗(yàn)表明EphrinB2的磷酸化信號(hào)是神經(jīng)系統(tǒng)血管網(wǎng)絡(luò)正常發(fā)育的關(guān)鍵[6]。在發(fā)育中視網(wǎng)膜血管的EphrinB2被磷酸化，一旦發(fā)育完成，視網(wǎng)膜血管上EphrinB2立刻去磷酸化[7]。這提示磷酸化可能是一種活性形式。另外Ephrins在神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育的軸突導(dǎo)向、后腦分化、神經(jīng)嵴細(xì)胞遷移等過(guò)程中具有關(guān)鍵作用。在成年后，EphrinBs主要參與突觸形成及其可塑性，以及對(duì)成年神經(jīng)干細(xì)胞的增殖分化調(diào)節(jié)等作用。

最新的研究證據(jù)有，M?nsson-Broberg等通過(guò)結(jié)扎大鼠心臟的左前降支制作心肌梗死模型，向該模型中注射EphrinB2-Fc，同樣發(fā)現(xiàn)，心肌梗死半暗帶區(qū)的內(nèi)皮細(xì)胞的增殖增加，血管新生增強(qiáng)[8]。另外，有研究將大鼠的胸椎主動(dòng)脈取出，切成0.8 mm的片段，加入EphrinB2-Fc進(jìn)行培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)EphrinB2可促進(jìn)主動(dòng)脈上微血管的新生，其作用強(qiáng)度相當(dāng)于血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子的作用強(qiáng)度[6]。說(shuō)明在一些病理?xiàng)l件下，該通路的活化可以促進(jìn)血管的新生。在成年人胸段脊髓橫斷損傷后，病灶區(qū)EphrinB2的表達(dá)量在第1天時(shí)先下降，隨后在第14天時(shí)顯著增加[9]。

本文的創(chuàng)新點(diǎn)在于，首次將EphrinB2信號(hào)通路引入腦卒中的研究。研究EphrinB2信號(hào)在缺血性腦卒中后血管、神經(jīng)中的表達(dá)及其功能，對(duì)腦卒中的研究具有重要意義，符合“神經(jīng)血管單元”學(xué)說(shuō)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組

健康成年雄性Sprague-Dawley大鼠24只，體重250～280 g，由北京斯貝福實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，許可證號(hào)：SCXK(京)20011-0004。清潔級(jí)飼養(yǎng)，預(yù)適應(yīng)環(huán)境1周后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

將大鼠編號(hào)1～24號(hào)，用隨機(jī)數(shù)表字法分為假手術(shù)組和模型組，每組12只。

1.2 主要儀器和試劑

尼龍栓線，直徑0.26 mm(2634-100)：北京沙東生物技術(shù)有限公司；美國(guó)bio-RAD Powerpac Basic電泳干轉(zhuǎn)儀：普利萊生物技術(shù)有限公司；美國(guó)Thermo Scientific輪轉(zhuǎn)式切片機(jī)：上海徠卡儀器有限公司；日本Olympus BX51顯微鏡：日本Olympus光學(xué)工業(yè)株式會(huì)社；免疫組化試劑盒SP-9000：北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司；DAB顯色試劑盒：上海基因科技有限公司；磷酸化EphrinB2(p-EphrinB2)抗體(3481s)：美國(guó)CST；Image-Pro Plus6.0圖像分析軟件。

1.3 造模

大鼠大腦中動(dòng)脈阻塞(middle cerebral artery occlusion,MCAO)模型的制作，造模方法參考Longa[10]方法。大鼠以10%水合氯醛350 mg/kg腹腔麻醉。切開(kāi)右側(cè)頸部，逐層分離暴露右頸總動(dòng)脈，結(jié)扎翼腭動(dòng)脈和頸外動(dòng)脈，將線栓經(jīng)頸總動(dòng)脈插入約18～20 mm至大腦中動(dòng)脈近端，阻斷大腦中動(dòng)脈血供30 min后，拔出尼龍線。假手術(shù)組只分離動(dòng)脈結(jié)扎，不插線。大鼠蘇醒后參照Longa[10]方法評(píng)分：0分，未見(jiàn)神經(jīng)病學(xué)征象，無(wú)神經(jīng)功能缺損癥狀；1分，大鼠被提尾倒懸時(shí)，病灶右側(cè)前肢屈曲、抬高，不能伸展右側(cè)前爪；2分，行走時(shí)對(duì)側(cè)旋轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)圈；3分，行走困難并向?qū)?cè)傾倒；4分，不能自發(fā)行走，意識(shí)水平呈下降狀態(tài)。達(dá)到1～3分為造模成功，采用差額補(bǔ)充的方法補(bǔ)足每組的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物數(shù)。

1.4 觀察指標(biāo)

1.4.1 Western blotting檢測(cè) 各組大鼠分別于造模7 d后每組隨機(jī)取3只大鼠的腦皮層，新鮮取材置于液氮中，-80℃保存。加RIPA裂解緩沖液(普利萊生物技術(shù)有限公司)7倍腦皮層質(zhì)量的體積，粉碎、裂解、提取總蛋白。BCA法測(cè)定蛋白濃度，并用裂解液調(diào)節(jié)各組蛋白濃度，加上樣緩沖液煮沸10 min，取60μg蛋白樣品在10%十二烷基硫酸鈉(SDS)-聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉(zhuǎn)膜，5%脫脂奶粉搖床室溫封閉1 h，p-EphrinB2一抗(1∶1000)4℃過(guò)夜，洗膜緩沖液(TBST)5 min，洗3次，辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔二抗(1∶2000)室溫孵育1 h，進(jìn)行ECL試劑化學(xué)發(fā)光法(Thermo公司)顯色，然后曝光顯影。用QuantityOne分析軟件對(duì)顯影條帶進(jìn)行灰度分析，用p-EphrinB2與actin灰度值的比值表示p-EphrinB2的表達(dá)水平，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.4.2 免疫組織化學(xué)染色 各組大鼠分別于造模7 d后隨機(jī)取6只。10%水合氯醛20 ml/kg腹腔注射麻醉，固定于手術(shù)臺(tái)，剪開(kāi)胸腔，仔細(xì)剪開(kāi)心包膜，暴露心臟，用9號(hào)針頭插入左心室，灌注生理鹽水，待右心耳膨起，剪開(kāi)右心耳讓血液流出；至右心耳流出液無(wú)色透明時(shí)，改用4%多聚甲醛灌注固定。固定0.5 h后開(kāi)顱取腦，將腦組織浸于4%多聚甲醛中。在梗死區(qū)取腦組織于50%、75%、85%、95%、100%乙醇梯度脫水；二甲苯透明；浸蠟包埋。連續(xù)冠狀切片，厚20μm。石蠟切片常規(guī)脫蠟脫水，浸入0.01 mol/L枸櫞酸鹽緩沖液(pH=6.0)中，微波修復(fù)；冷卻至室溫后，0.1 mol/L TBST洗滌3次，每次3 min；置3%H2O2去離子水孵育10 min；TBST沖洗3次，每次3 min；滴加正常山羊血清，室溫孵育60 min，傾去；分別滴加1∶50的p-EphrinB2的一抗，置于4℃孵育48 h；TBST沖洗3次，每次3 min；滴加生物素標(biāo)記山羊抗兔IgG，37℃孵育60 min，TBST沖洗3次，每次3 min；滴加辣根酶標(biāo)記鏈酶卵白素工作液，37℃孵育60 min，TBST沖洗3次，每次3 min；滴加DAB顯色試劑，室溫顯色，顯微鏡下控制反應(yīng)時(shí)間，顯色后，蒸餾水洗滌終止反應(yīng)。蘇木素輕度復(fù)染，自來(lái)水水洗；1%鹽酸酒精稍分色后蘭化片刻；常規(guī)脫水、透明、中性樹(shù)膠封片。用正常山羊血清替代一抗作陰性對(duì)照。

OlympusBX51顯微鏡觀察并攝片，采用利用Image-Pro Plus 6.0圖像分析軟件分別計(jì)算p-EphrinB2陽(yáng)性神經(jīng)細(xì)胞的數(shù)目。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

用SPSS 20.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，采用Student'st檢驗(yàn)進(jìn)行組間比較。顯著性水平α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 行為學(xué)評(píng)分

模型組行為學(xué)評(píng)分1～3分，平均(2.25±0.25)分，造模成功。

2.2 Western blotting檢測(cè)p-EphrinB2表達(dá)

模型組大腦皮層的p-EphrinB2表達(dá)量高于假手術(shù)組(P<0.05)。見(jiàn)

圖1 Western blotting檢測(cè)兩組大腦皮層p-EphrinB2水平

2.3 免疫組化檢測(cè)p-EphrinB2表達(dá)

模型組大腦皮層血管內(nèi)皮有p-EphrinB2的表達(dá)。見(jiàn)圖2。模型組大腦皮層表達(dá)的p-EphrinB2陽(yáng)性神經(jīng)細(xì)胞數(shù)目明顯多于假手術(shù)組(P<0.01)。見(jiàn)圖3、表1。

圖2 模型組皮層血管內(nèi)皮細(xì)胞中有p-EphrinB2的表達(dá)(400×)

圖3 兩組大腦皮層中EphrinB2陽(yáng)性神經(jīng)細(xì)胞的表達(dá)(400×)

表1 p-EphrinB2在腦皮層中的表達(dá)量及其陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)

3 討論

腦卒中發(fā)生后神經(jīng)修復(fù)再生過(guò)程包括神經(jīng)發(fā)生、血管新生以及突觸發(fā)生和軸突再生[11]。神經(jīng)干細(xì)胞的血管微環(huán)境對(duì)神經(jīng)發(fā)生調(diào)節(jié)起至關(guān)重要的作用[12]。以往缺血性腦血管病的研究較注重神經(jīng)細(xì)胞，而對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞的關(guān)注相對(duì)不夠。腦缺血后神經(jīng)和血管的相互聯(lián)系作用是現(xiàn)在腦卒中研究的熱點(diǎn)之一。缺血性腦卒中發(fā)生后，EphrinBs的功能是未知的。我們對(duì)EphrinBs是否恢復(fù)發(fā)育時(shí)期的功能了解得也很少。

Western blotting結(jié)果顯示，模型組大鼠大腦皮層的p-EphrinB2表達(dá)量高于假手術(shù)組。免疫組化觀察模型組大鼠大腦皮層表達(dá)p-EphrinB2的陽(yáng)性神經(jīng)細(xì)胞數(shù)目也明顯增加，并且血管內(nèi)皮有p-EphrinB2的表達(dá)，說(shuō)明大鼠缺血性腦卒中后EphrinB2信號(hào)通路被激活。因?yàn)镋phrinB2信號(hào)通路能夠促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞的增殖和誘導(dǎo)血管側(cè)枝的芽生[8]，磷酸化EphrinB2在內(nèi)皮細(xì)胞中的出現(xiàn)，說(shuō)明該通路很可能在腦卒中后損傷區(qū)域的血管新生中起作用，并且EphrinB2信號(hào)通路能夠促進(jìn)神經(jīng)干細(xì)胞的增殖、遷移以及軸突的可塑性等[13-15]。所以磷酸化EphrinB2表達(dá)水平升高，提示該通路可能在缺血性腦卒中損傷后的神經(jīng)修復(fù)中起作用。因此EphrinB2通路在腦卒中后的激活可能既促進(jìn)神經(jīng)恢復(fù)，也能促進(jìn)血管新生，有一定的臨床意義。

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