單玉芳，任志麗，左萍萍

流行病學(xué)資料表明，絕經(jīng)期婦女的阿爾茨海默病(AD)發(fā)病率較同齡男性高1.5～3倍[1-3]。北京協(xié)和醫(yī)院對北京兩區(qū)一縣5000多名老年人的調(diào)查結(jié)果顯示，婦女絕經(jīng)后期AD的患病率呈幾何級數(shù)增長[4]。無論城市還是農(nóng)村，75歲以上女性發(fā)病率均高于男性，提示雌激素與AD之間有某種聯(lián)系。已知雌激素本身具有營養(yǎng)及抗氧化的特點(diǎn)，在預(yù)防AD方面具有保護(hù)作用[5]，這引起人們極大興趣。但長期使用對子宮、乳房的副作用又限制雌激素替代療法(estrogen replacement therapy,ERT)的廣泛應(yīng)用。α-玉米赤霉醇(α-zearalanol,α-ZAL)是一種冬小麥春化的關(guān)鍵物質(zhì)，并是植物中普遍存在的內(nèi)源性激素玉米赤霉烯酮(zearanone,ZEN)的還原產(chǎn)物，具有類雌激素樣效應(yīng)，但比雌激素安全。本研究觀察其對AD動(dòng)物模型的認(rèn)知行為的改善作用及部分機(jī)制，并與苯甲酸雌二醇(estradiol benzoate,EB)作對照。

1 材料和方法

1.1 藥物與試劑

EB：上海第九制藥廠；α-ZAL：中國農(nóng)業(yè)大學(xué)生物學(xué)院李季倫教授惠贈(zèng)；β-淀粉樣蛋白(β-amyloid,Aβ25-35)：美國SIGMA公司；超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)、谷胱甘肽過氧化物酶(glutathione peroxidase,GSH-Px)、丙二醛(malonaldehyde,MDA)試劑盒：南京建成生物工程研究所；一氧化氮合酶(NOS)系列試劑盒：中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所同位素室提供；小鼠Morris水迷宮：北京碩林苑科技有限公司。

1.2 動(dòng)物及分組

40只昆明種成年雌性小白鼠，由中國食品藥品檢定研究院國家嚙齒類實(shí)驗(yàn)動(dòng)物種子中心提供。按隨機(jī)方法分為對照組、模型組、EB組和α-ZAL組，每組10只。飼養(yǎng)于SPF級環(huán)境，12 h周期明暗，自由進(jìn)食、水。室溫保持20～25℃。小鼠適應(yīng)環(huán)境1周后開始實(shí)驗(yàn)，除對照組外，其他小鼠于第7天造模。

1.3 模型制備

除對照組外，其他組Aβ25-35腦室內(nèi)注射建立小鼠擬AD癡呆模型。參照Telegdy[6]的方法，對小鼠一側(cè)側(cè)腦室進(jìn)行定位。用10μl微量注射器在其雙耳前緣連線中點(diǎn)偏右1 mm處垂直骨面進(jìn)針，深度約1 mm，一次性注射Aβ25-353 nmol，或相同劑量滅菌蒸餾水(對照組)。術(shù)后連續(xù)3 d，肌肉注射青霉素4×104U/d。

1.4 給藥

對照組和模型組：肌肉注射橄欖油0.05 ml/d，共14 d；EB組：肌肉注射EB 0.1 nmol/d，共14 d；α-ZAL組：肌肉注射α-ZAL 0.1 nmol/d，共14 d。

1.5 Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)

水迷宮裝置由一直徑1.5 m的圓桶及運(yùn)動(dòng)視頻捕捉系統(tǒng)組成。實(shí)驗(yàn)開始前，向桶內(nèi)注入清水，調(diào)節(jié)水溫至20℃，然后在桶內(nèi)放置一圓形實(shí)臺(tái)，臺(tái)面沒水2 cm左右，用碳素墨水將水調(diào)黑，以免動(dòng)物看到實(shí)臺(tái)。實(shí)驗(yàn)時(shí)，將動(dòng)物頭朝桶壁放入水中，小鼠自由游動(dòng)尋找實(shí)臺(tái)，水桶上方的視頻系統(tǒng)捕捉其泳動(dòng)軌跡。第一次實(shí)驗(yàn)時(shí)，由小鼠在90 s內(nèi)自主尋找到實(shí)臺(tái)并在臺(tái)上停留15 s；如果小鼠在90 s內(nèi)未能找到實(shí)臺(tái)，將其放置臺(tái)上15 s，然后取出。訓(xùn)練4次后，第5次實(shí)驗(yàn)記錄小鼠尋臺(tái)時(shí)間，記為尋臺(tái)潛伏期。

1.6 組織樣品的處理

小鼠低溫下快速取出全腦，分離出大腦皮層和海馬，置液氮中速凍后保存于-70℃冰箱備用。

1.7 腦組織SOD、GSH-Px活力及MDA含量測定

鼠腦組織以冷生理鹽水沖洗，濾紙拭干，稱重，冰浴中用玻璃勻漿器按重量體積比1∶15制備勻漿，4000 g離心10 min；去沉淀，取適量上清液。測定方法按照試劑盒操作說明進(jìn)行，721分光光度計(jì)采用相應(yīng)波長測定光密度(OD)值，按相應(yīng)公式計(jì)算酶活力及MDA含量。

1.8 NOS活性和NO含量測定

按3H-左旋精氨酸轉(zhuǎn)換法測定原生型NOS(cNOS)和誘生型(iNOS)活性[9]；

蒸餾水配制0.1%萘乙稀二胺，以5%磷酸配制1%對氨基苯磺酸酰胺，二者等體積混合即為Griess反應(yīng)試劑。取該試劑100μl與樣品100μl混勻10 min，用全自動(dòng)酶標(biāo)儀測定，測定波長為570 nm，以亞硝酸鈉的標(biāo)準(zhǔn)濃度曲線進(jìn)行定量，并結(jié)合蛋白濃度計(jì)算亞硝酸鹽含量。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，采用單因素方差分析和非配對資料組間雙側(cè)t檢驗(yàn)，結(jié)果以表示，顯著性水平α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 小鼠Morris水迷宮測定結(jié)果

模型組潛伏期較對照組明顯延長(P<0.01)。EB組和α-ZAL組潛伏期較模型組縮短(P<0.05)。α-ZAL組和EB組無顯著性差異(P>0.05)。見表1。

表1 三組小鼠末次尋臺(tái)潛伏期

2.2 SOD、GSH-Px活力及MDA含量

模型組小鼠大腦皮層、海馬的SOD、GSH-Px活性較對照組降低(P<0.05)，MDA水平升高(P<0.05)；除α-ZAL組海馬SOD外(P>0.05)，EB組和α-ZAL組SOD、GSH-Px活性增加(P<0.05)，MDA水平降低(P<0.05)。α-ZAL組和EB組無顯著性差異(P>0.05)。見表2。

2.3 NOS活性和NO含量

模型組小鼠大腦皮層、海馬部位的兩種NOS和NO含量均升高(P<0.05)。除α-ZAL組海馬cNOS外(P>0.05)，EB組和α-ZAL組的兩種NOS和NO含量均下降(P<0.05)。α-ZAL組和EB組無顯著性差異(P>0.05)。見表3。

表2 三組小鼠海馬、大腦皮層氧化應(yīng)激指標(biāo)的變化(n=6～10)

表3 三組小鼠海馬、大腦皮層NO系統(tǒng)的變化(n=6～10)

3 討論

α-ZAL廣泛存在谷類、豆類、蔬菜等植物中。國外科學(xué)家用大量實(shí)驗(yàn)證明它是高效、安全的植物雌激素，代謝快、無體內(nèi)殘留，無組織增生等副作用，因此美國食品和藥物管理局(FDA)已批準(zhǔn)α-ZAL作為食草反芻動(dòng)物的生長促進(jìn)劑被廣泛應(yīng)用[10]。李季倫等發(fā)現(xiàn)并證實(shí)，α-ZAL是植物中普遍存在的內(nèi)源性激素，與高等植物發(fā)育有關(guān)，與冬小麥春化有關(guān)，并純化精制α-ZAL[11]。受此啟發(fā)，Dai等將α-ZAL引入動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，在國內(nèi)外首次報(bào)道α-ZAL對去卵巢高脂飼養(yǎng)的新西蘭家兔動(dòng)脈粥樣硬化的防治作用[12]以及對血脂代謝及血液流變學(xué)的影響[13]，并與其他雌激素的抗動(dòng)脈硬化作用進(jìn)行比較，得出結(jié)論：α-ZAL具有明顯減輕血管內(nèi)膜斑塊形成、減少iNOS表達(dá)、保護(hù)血管內(nèi)皮的作用；而α-ZAL的子宮增重作用明顯小于17β雌二醇和戊酸雌二醇；與子宮雌激素受體的50%結(jié)合率僅為17β雌二醇的1/10，對乳腺的刺激作用明顯小于17β雌二醇[14]。

在上述動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，我們設(shè)想α-ZAL除了防治動(dòng)脈粥樣硬化之外，還有可能具有調(diào)節(jié)腦功能的作用，包括老年性癡呆。

本研究觀察到，腦室注射Aβ后明顯降低小鼠的空間學(xué)習(xí)記憶能力，這與Aβ過度激活NOS，釋放過量NO有關(guān)。正常情況下NO可調(diào)節(jié)突觸的可塑性、神經(jīng)發(fā)育和學(xué)習(xí)記憶，但過量釋放的情況下即可引起神經(jīng)毒性。α-ZAL和EB均能拮抗Aβ的神經(jīng)毒性，這與報(bào)道過的雌激素抑制N-甲基-D-天冬氨酸(N-Methyl-D-Aspartate,NMDA)受體過度激活、拮抗鈣離子進(jìn)入細(xì)胞，從而減少NOS產(chǎn)生及NO釋放的機(jī)制相吻合[5,15]。

近年普遍認(rèn)為，雌激素是膜磷脂過氧化反應(yīng)的天然抗氧化劑，其作用依賴于甾體激素A環(huán)Cs位置上羥基的完整性。雌激素通過抗氧化機(jī)制拮抗Aβ的毒性，而其他甾體類激素如孕激素、醛固酮、皮質(zhì)酮都無此作用。α-ZAL是二羥基苯酸內(nèi)酯類化合物，和雌激素有相似的化學(xué)結(jié)構(gòu)。本實(shí)驗(yàn)觀察到模型小鼠大腦皮層、海馬的抗氧化酶SOD、GSH-Px活性較對照組明顯降低，脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物MDA水平顯著升高，經(jīng)EB、α-ZAL預(yù)防治療后恢復(fù)正常。該效果與我們在PC12神經(jīng)細(xì)胞試驗(yàn)觀察到的結(jié)果一致[16]。近年我們的實(shí)驗(yàn)則進(jìn)一步證明α-ZAL可通過拮抗神經(jīng)細(xì)胞DNA氧化應(yīng)激反應(yīng)明顯改善去卵巢大鼠的學(xué)習(xí)記憶損傷[17]?？傊?，α-ZAL在逆轉(zhuǎn)Aβ毒性方面和EB的作用相當(dāng)。由于α-ZAL具有其他雌激素不可替代的優(yōu)點(diǎn)，它很有可能在未來對絕經(jīng)后婦女的腦保護(hù)方面發(fā)揮積極的作用。

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