張 潔 盧玲玲 潘曉夫 鄒立林 高基民

(溫州醫(yī)科大學(xué)檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院，溫州 325035)

在中國(guó)，每年大約新發(fā)500萬(wàn)例急性心肌梗死(Acute myocardial infarction，AMI)，并呈快速增長(zhǎng)的趨勢(shì)。AMI起病急，病死率高，隨著現(xiàn)代醫(yī)學(xué)手段的進(jìn)步，AMI的致死率已從30%下降到10%，但仍大約有54萬(wàn)的AMI患者在發(fā)病的第一周死亡［1］。因此尋找一個(gè)早期快速準(zhǔn)確診斷AMI的心肌標(biāo)志物刻不容緩。cTnI(cardiactroponin I，cTnI)是目前WHO推薦的急性心肌梗死早期診斷、疾病監(jiān)測(cè)和預(yù)后評(píng)價(jià)的心肌標(biāo)志物。肌鈣蛋白I(cTnI)是組成心肌肌鈣蛋白復(fù)合物的亞單位之一，具有高度的心肌特異性?？焖佟㈧`敏、準(zhǔn)確測(cè)定人血中的cTnI對(duì)于診斷急性心肌梗死、急性冠狀動(dòng)脈綜合征的危險(xiǎn)分層、監(jiān)測(cè)各種因素所導(dǎo)致的心肌損傷以及心臟事件的判斷預(yù)后等有著重要的意義［2］。

目前，檢測(cè)cTnI的方法有酶聯(lián)免疫吸附法。膠體金法。質(zhì)譜法以及微粒子化學(xué)發(fā)光法等等。由于檢測(cè)方法的多樣性，因此尚未統(tǒng)一建立一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)化的檢測(cè)系統(tǒng)，造成了不同醫(yī)院和實(shí)驗(yàn)室之間的參考范圍不一致，結(jié)果不統(tǒng)一，延誤AMI的診斷和治療。建立一個(gè)統(tǒng)一的cTnI參考范圍以及標(biāo)準(zhǔn)化檢測(cè)系統(tǒng)是刻不容緩的。

時(shí)間分辨熒光免疫分析技術(shù)(Time resolved fluorescence immunoassay，TRFIA)是繼放射免疫技術(shù)、酶聯(lián)免疫吸附技術(shù)、免疫熒光技術(shù)和化學(xué)發(fā)光免疫技術(shù)之后的新一代免疫學(xué)診斷技術(shù)，它以鑭系元素稀土離子標(biāo)記為特征，具有反應(yīng)迅速、靈敏度高、信噪比低及無(wú)放射性污染等優(yōu)勢(shì)，具有更寬的檢測(cè)線性范圍及更好的檢測(cè)性能。標(biāo)準(zhǔn)化的TRFIA檢測(cè)系統(tǒng)已經(jīng)在白喉的毒素中和試驗(yàn)以及風(fēng)疹的疾病監(jiān)控中作為標(biāo)準(zhǔn)方法［3-5］。

本文中，我們創(chuàng)建的時(shí)間分辨熒光免疫分析結(jié)合雙抗體夾心技術(shù)快速準(zhǔn)確檢測(cè)血清中的cTnI，通過(guò)優(yōu)化這一新型的TFRIA檢測(cè)系統(tǒng)并將其運(yùn)用于臨床后，與心肌損傷的其他傳統(tǒng)診斷方法相比，具有操作簡(jiǎn)單、靈敏度高和無(wú)放射性污染等優(yōu)勢(shì)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)標(biāo)本 采集532份無(wú)抗凝劑的空腹血，37℃孵育15～30 min，凝固后3 000 r/min離心5 min，分離上清，保存至－80℃，待用。所有標(biāo)本采集于2013年3月～7月瑞安市人民醫(yī)院和瑞安市中醫(yī)院，所有病人均告知《受試者知情同意書》。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 試劑和儀器 牛血清白蛋白(BSA)，疊氮鈉(NaN3)及吐溫-20購(gòu)自 Sigma-Aldrich.(St.Louis，MO，USA);鼠源的單克隆 cTnI抗體(catalog H86465M以及K31341G)以及cTnI標(biāo)準(zhǔn)品購(gòu)自Meridian(Life Science，Inc.);SephadexG-50 購(gòu)自 Pharmacia公司Eu3+標(biāo)記試劑盒、Eu3+熒光增強(qiáng)液及PE2030型時(shí)間分辨熒光免疫檢測(cè)系統(tǒng)均購(gòu)自Perkin Elmer公司產(chǎn)品;帶有濾膜的離心管購(gòu)自Millipore公司。

1.2.2 固相包被抗體的制備 用碳酸鹽緩沖液抗cTnI單克隆抗體 H86465M 稀釋成 3 μg/ml，每孔100 μl加入到96孔板中，4℃孵育過(guò)夜。第二天從4℃ 冰箱中取出昨天包被的96孔板，傾去包被液，拍干;加入含有2%BSA的封閉液，每孔150 μl，室溫封閉2 h，傾去封閉液，拍干，鋁箔袋真空包裝，－20℃冷凍保存。

1.2.3 Eu3+標(biāo)記抗體的制備和純化 標(biāo)記前抗cT-nI單克隆抗體K31341G(1 mg，5.56 mg/ml)進(jìn)行標(biāo)記前純化處理，以除去磷酸鹽、疊氮鈉等干擾標(biāo)記反應(yīng)的物質(zhì)，將螯合試劑加入到盛有待標(biāo)記抗體K31341G的EP管中，混合均勻。置于冷庫(kù)環(huán)境中的搖床上孵育，4℃ 過(guò)夜(孵育時(shí)間至少14 h)。用Sephadex-50對(duì)樣品進(jìn)行洗脫，蛋白檢測(cè)儀顯示出現(xiàn)蛋白峰時(shí)(約5 min)，開(kāi)始收集樣品。根據(jù)280 nm蛋白的吸光度的高低選擇吸光度高的幾管合并，并用0.22 μm濾膜對(duì)目的產(chǎn)物進(jìn)行過(guò)濾除菌。標(biāo)記抗體的長(zhǎng)期保存方法:將高純度的BSA加入到標(biāo)記抗體溶液中，BSA終濃度為0.1%，4℃ 或－20℃ 保存。

1.3 分析性能評(píng)價(jià)

1.3.1 標(biāo)記抗體穩(wěn)定性 標(biāo)記抗體分別在37℃保存7 d以及在4℃保存半年和一年。將cTnI標(biāo)準(zhǔn)蛋白稀釋成 6 個(gè)濃度(0、0.24、1.2、6.0、30.0、150 μg/L)來(lái)驗(yàn)證標(biāo)記抗體的穩(wěn)定性。

1.3.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制 將cTnI標(biāo)準(zhǔn)蛋白稀釋成0 μg/L(A)，0.5 μg/L(B)，2.5 μg/L(C)，12.5 μg/L(D)，62.5 μg/L(E)以及312.5 μg/L(F)六個(gè)點(diǎn)，每個(gè)點(diǎn)測(cè)試5次，并由PE2030自帶軟件繪制成標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.3.3 空白及最低檢測(cè)限 空白及最低檢測(cè)限嚴(yán)格按照國(guó)際臨床化學(xué)標(biāo)準(zhǔn)委員會(huì)(NCCLS)的EP17-A程序進(jìn)行檢測(cè)?？瞻讬z測(cè)限使用的是無(wú)cTnI蛋白的血清標(biāo)本;最低檢測(cè)限采用無(wú)AMI的患者血清，稀釋5倍后檢測(cè)。空白及最低檢測(cè)限檢測(cè)標(biāo)本均分為兩個(gè)批次，檢測(cè)6次，連續(xù)5 d。

1.3.4 分析精密度 根據(jù)國(guó)際臨床化學(xué)標(biāo)準(zhǔn)委員會(huì)(NCCLS)的EP5-A2方案，分別用三個(gè)批次(標(biāo)記為20121110、20130512和20131117)的試劑檢測(cè)血清中 cTnI高、中、低三個(gè)濃度(0.75 μg/L、3.75 μg/L和 187.5 μg/L)各3次/d，連續(xù)20 d，分別計(jì)算批內(nèi)及批間的變異系數(shù)。

1.3.5 正常參考范圍 檢測(cè)300份無(wú)明顯臨床疾病的正常體檢血清標(biāo)本(男∶女 =162∶138，年齡38.63±15.98歲，無(wú)X光，心電圖及血糖血脂的改變)，確定TRFIA法檢測(cè)cTnI的正常參考范圍。

1.3.6 方法學(xué)比較 將86份標(biāo)本同時(shí)進(jìn)行CLIA(微粒子電化學(xué)發(fā)光法chemiluminescent immun-oassay，CLIA，儀器 Architect I2000，試劑批號(hào) Architect cTnI kit code 41059UN13)和TRFIA(時(shí)間分辨免疫檢測(cè)法)檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行線性回歸計(jì)算其相關(guān)系數(shù)。

1.3.7 臨床應(yīng)用 通過(guò)對(duì)臨床上的cTnT，CK-MB(由CLIA法檢測(cè))和心電圖以及治療前后cTnI(由TRFIA法檢測(cè))的比較，驗(yàn)證TRFIA法檢測(cè)cTnI的診斷及疾病監(jiān)測(cè)效能。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 所有的統(tǒng)計(jì)結(jié)果由SPSS18.0計(jì)算得到，P＜0.05認(rèn)為具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

2 結(jié)果

2.1 Eu3+標(biāo)記抗體的穩(wěn)定性 試劑在37℃ 7 d以及在4℃半年或一年均保持穩(wěn)定，見(jiàn)表1。

表1 標(biāo)記抗體的穩(wěn)定性Tab.1 Stability of antibody

2.2 空白及最低檢測(cè)限 所有的數(shù)據(jù)呈正態(tài)分布，空白檢測(cè)限(LoB)為 0.028 μg/L;最低檢測(cè)限(LoD)為 0.052 μg/L(計(jì)算公式:LoB:0.002 0 ±0.013 0，LoB=average+2SD;LoD:0.005 2 ±0.011 9，LoD=LoB+2SD)。

2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線及線性范圍 標(biāo)準(zhǔn)曲線:Y=7 485.878+1 400.924X，Y代表熒光值，X為cTnI濃度，相關(guān)系數(shù)為0.999，線性范圍為0.0～312.5 μg/L，見(jiàn)圖1。

2.4 精密度 高中低三個(gè)血清cTnI濃度的變異系數(shù)(CV)分別為:批號(hào)20121110為9.1%、9.2%和4.4%;批號(hào)20130512為7.1%、4.5%和3.6%;批號(hào)20131117為4.2%、6.2%和7.2%。批間變異系數(shù)分別為9.4%、8.8%和10%。批內(nèi)以及批間的變異系數(shù)均符合中國(guó)體外診斷試劑的標(biāo)準(zhǔn)［6］。見(jiàn)表2、3。

2.5 參考范圍 檢測(cè)300例健康體檢病人得到的cTnI結(jié)果符合正態(tài)分布，其平均值為0.03 μg/L，標(biāo)準(zhǔn)差為0.055，得出TRFIA法檢測(cè)血清cTnI的95%可信區(qū)間為 ＜0.14 μg/L。將血清中 cTnI值大于0.14 μg/L的患者認(rèn)定為cTnI陽(yáng)性。見(jiàn)圖2。

表2 批內(nèi)精密度Tab.2 Results of intra-assay precision

表3 批間的精密度(n=3×8)Tab.3 Results of inter-assay precision(n=3 ×8)

表4 TRFIA方法的敏感性和特異性Tab.4 Sensitivity and specificity of TRFIA

2.6 ROC工作曲線 為了繪制TRFIA檢測(cè)血清cTnI的ROC工作曲線，收集232份疑似AMI患者血清(男∶女 =118∶114，年齡18～86 歲，平均53.61 ±13.00歲)。結(jié)合臨床，共有197名患者確診為AMI。TRFIA的敏感性為96.45%，特異性為91.43%，準(zhǔn)確度為95.69%，陽(yáng)性預(yù)示值為98.45%，陰性預(yù)示值為82.05%。ROC的曲線下面積(AUC)為0.971。見(jiàn)表4、圖 3。

2.7 方法學(xué)比較 為了進(jìn)一步驗(yàn)證TRFIA法的臨床應(yīng)用效能，收集86份患者血清，用TRFIA法以及臨床在用的CLIA法同時(shí)進(jìn)行檢測(cè)。線性回歸結(jié)果顯示，兩者具有良好的相關(guān)，回歸方程為Y=0.727X+0.338(Y為CLIA法結(jié)果，X為TRFIA法結(jié)果)，相關(guān)系數(shù)為0.993。該結(jié)果顯示，我們新創(chuàng)的TFRIA法可用于臨床血清標(biāo)本中cTnI的檢測(cè)，見(jiàn)圖4。

2.8 臨床的應(yīng)用 與傳統(tǒng)用于診斷AMI的心電圖(Electrocardiography，ECG)［22］，肌酸激酶同工酶 MB(creatine kinase-MB，CK-MB)和 cTnT(cardiac-troponin T，cTnT)對(duì)比后顯示:TRFIA檢測(cè)的血清cTnI與上述三種指標(biāo)沒(méi)有顯著差異，其P值分別為0.258、0.848和0.828。

圖1 TRFIA方法的標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 Standard curve of TRFIA method

圖2 參考范圍的正態(tài)分布圖Fig.2 Gaussian curve of reference values

圖3 TRFIA的ROC工作曲線Fig.3 ROC curve of TRFIA

圖4 CLIA和TRFIA方法比較的線性回歸圖Fig.4 Comparison between CLIA and TRFIA

表5 cTnI和ECG的比較Tab.5 Comparison between results of cTnI and ECG

為了驗(yàn)證cTnI在監(jiān)測(cè)疾病進(jìn)程中的作用，我們收集了81例臨床確診的AMI患者的第1天及治療后第7天的血清標(biāo)本，結(jié)果顯示:第1天患者血清中cTnI濃度為(111.76±57.03)μg/L，第7天的血清濃度為(1.81±1.31)μg/L，該結(jié)果具有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，提示TRFIA方法檢測(cè)的血清cTnI具有較好的疾病檢測(cè)作用。見(jiàn)表5。

3 討論

目前已有多種實(shí)驗(yàn)室診斷方法應(yīng)用于急性心肌梗死的臨床診斷。從檢測(cè)原理方面來(lái)看，基本上可分為熒光免疫分析法、放射免疫分析法、酶免疫分析法、化學(xué)發(fā)光免疫分析法和時(shí)間分辨熒光免疫分析法等。酶免疫分析法及化學(xué)發(fā)光免疫分析法現(xiàn)已應(yīng)用于急性心肌梗死的臨床診斷。時(shí)間分辨熒光免疫分析法較目前使用的ELISA、化學(xué)發(fā)光免疫分析、膠體金分析等，具有更高的靈敏度和更寬的線性范圍，定量準(zhǔn)確快速，從而對(duì)急性心肌梗死、輕微心肌缺血性損傷、不穩(wěn)定性心絞痛和心肌炎等疾病做出更為準(zhǔn)確的診斷，具有廣闊的產(chǎn)業(yè)化前景。

在本研究中，我們成功構(gòu)建時(shí)間分辨熒光免疫分析法(TRFIA)檢測(cè)肌鈣蛋白I(cTnI)。該檢測(cè)方法的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為Y=7 485.878+1 400.924X，劑量-反應(yīng)線性相關(guān)系數(shù)為0.999，標(biāo)準(zhǔn)曲線檢測(cè)范圍是0.0～312.5 μg/L，檢測(cè)體系最低檢測(cè)量為0.052 μg/ml，穩(wěn)定性試驗(yàn)表明三批不同保存時(shí)間和條件的檢測(cè)用試劑相應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)曲線未發(fā)生明顯偏移。TRFIA方法檢測(cè)cTnI標(biāo)準(zhǔn)品的批內(nèi)精密度和批間精密度均＜10%，符合2010版《中國(guó)藥典》中有關(guān)體外診斷試劑的應(yīng)用要求［6］。

通過(guò)對(duì)300例健康體檢人員血清標(biāo)本的檢測(cè)結(jié)果確定TRFIA方法檢測(cè)cTnI的參考范圍，確立TRFIA方法檢測(cè)血清標(biāo)本中cTnI陽(yáng)性確認(rèn)值為0.14 μg/ml。該陽(yáng)性確認(rèn)值比2003年魏景艷［7］采用酶聯(lián)免疫分析法(Enzyme-linked immuno sorbent assay，ELISA)檢測(cè)血清標(biāo)本中cTnI濃度方法略低(其陽(yáng)性確認(rèn)值為0.8 μg/ml)，說(shuō)明TRFIA方法具有較高的靈敏度。

通過(guò)TRFIA方法檢測(cè)健康體檢人員血清標(biāo)本和急性心肌梗死患者血清標(biāo)本，得出TRFIA方法的敏感性為96.45%，特異性為91.43%，準(zhǔn)確度為95.69%;陽(yáng)性預(yù)示值為98.45%，陰性預(yù)示值為82.05%。ROC的曲線下面積(AUC)為0.971，該數(shù)據(jù)較為理想，結(jié)果特異可靠，能應(yīng)用于臨床，作為心肌損傷的特異性標(biāo)記物。

通過(guò)比較81位急性心肌梗死治療前后的兩組血清標(biāo)本，TRFIA方法檢測(cè)結(jié)果的差異明顯，P＜0.001，具有較好的AMI疾病監(jiān)測(cè)價(jià)值。

目前檢測(cè)cTnI較好的方法是采用電化學(xué)發(fā)光免疫分析，靈敏度較高而且能較為準(zhǔn)確地進(jìn)行定量分析，但需要昂貴的儀器和試劑。時(shí)間分辨熒光免疫分析作為最靈敏的免疫學(xué)檢測(cè)方法，在許多免疫指標(biāo)的檢測(cè)中較其他方法更具優(yōu)勢(shì):如更高的靈敏度、更寬的線性范圍，定量更精確等等。本試驗(yàn)成功的構(gòu)建了時(shí)間分辨檢測(cè)心肌肌鈣蛋白I方法并應(yīng)用于臨床。

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