羅 盈 王春苗 林 婷 羅燕飛 甘慧泉 周茂華

(廣東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院/廣東省人民醫(yī)院，廣州 510000)

異基因造血干細(xì)胞移植(Allogeneic haematopoietic stem cell transplantation，allo-HSCT)是目前治愈惡性血液病最有希望的手段，其最終目標(biāo)是通過(guò)供體來(lái)源的免疫效應(yīng)細(xì)胞發(fā)揮移植物抗腫瘤(Graftversus-leukemia，GVL)效應(yīng)清除異常克隆。但GVL往往伴隨移植物抗宿主病(Graft-versus-host disease，GVHD)的發(fā)生，引起多臟器的損傷，免疫缺陷和感染。目前GVHD仍然是影響造血干細(xì)胞移植的療效，限制其臨床廣泛應(yīng)用的主要因素之一?？刂艷VHD的發(fā)生成為造血干細(xì)胞移植中迫切需要解決的問(wèn)題。以往研究顯示，供體T細(xì)胞是誘導(dǎo)GVHD發(fā)生最為重要的致病細(xì)胞，這種致病性T細(xì)胞引起組織損傷，并伴有大量凋亡的發(fā)生［1］。本文就是探討在cGVHD患者外周血中CD45RA+與CD45RO+T細(xì)胞亞群的特點(diǎn)及其與病情之間的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 病例選擇 64例異基因造血干細(xì)胞移植患者均來(lái)自2001年3月至2009年9月廣東省人民醫(yī)院，其中男43例，女21例，年齡14～58歲，平均(29.6±9.1)歲。所有病例均首次植入成活，獲得造血重建。在64例患者中，未發(fā)生cGVHD發(fā)生21例，輕度cGVHD 15例，中度 cGVHD 18例，重度 cGVHD 10例。

1.2 方法

1.2.1 移植前預(yù)處理方案 改良的白消安/環(huán)磷酰胺(Bu/Cy)方案:Bu 1.0 mg/(kg·6 h)，用 3 d;阿糖孢苷(Ara-C)2 g/m2，1 次;Cy 60 mg/kg，2 次，或單次全身照射+環(huán)磷酰胺(TBI/Cy)方案以通知線加速器為照射源(單次全身照射700～800 cGy;Cy 1.8 g/m2，2 次)。

1.2.2 移植物抗宿主病(GVHD)預(yù)防 HLA相合移植后，給予環(huán)胞霉素A(CsA)、霉酚酸酯(MMF)及短程甲氨蝶呤(MTX)方案預(yù)防GVHD。HLA配型不合者靜脈滴注兔抗胸腺球蛋白(ATG)，2.5 mg/kg，3～4 d。

1.2.3 cGVHD的診斷和分級(jí)標(biāo)準(zhǔn) cGVHD的診斷主要是根據(jù)皮膚改變、口腔黏膜累及程度、肝功指標(biāo)、四肢關(guān)節(jié)累及情況以及病理結(jié)果進(jìn)行診斷。根據(jù)慢性移植物抗宿主病全球分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)［2］，綜合考慮患者臨床表現(xiàn)、實(shí)驗(yàn)室檢查結(jié)果、放射學(xué)特征等因素，人們把有cGVHD特征的患者依照器官受損范圍及程度分為輕、中、重度3級(jí)。輕度cGVHD:僅有1～2個(gè)器官或部位受損(肺除外)，無(wú)明顯功能影響(器官或部位受損為1級(jí));器官或部位受損1級(jí)時(shí)癥狀相對(duì)較輕，如:皮膚改變的面積＜18%且沒(méi)有硬化特征，口腔干燥、黏膜輕度萎縮但不影響進(jìn)食，ALT或AST低于正常上限值的2倍，體重減輕＜5%，關(guān)節(jié)輕度僵硬但不影響日常生活活動(dòng)等。中度cGVHD:①至少有1個(gè)器官或部位有表現(xiàn)，但大部分功能還存在(器官或部位受損為2級(jí));②3個(gè)或更多器官部位受損，但功能沒(méi)有完全損失(器官或部位受損為1級(jí))，肺部受損為1級(jí)，肺功能檢測(cè)指標(biāo):1 s用力呼氣容積(FEV1)為60%～79%或肺功能評(píng)分(LFS)3～5，走一樓層的階梯就感覺到呼吸困難。重度cGVHD:大部分功能受損，肺部受損為2級(jí)。器官或部位受損2級(jí)時(shí)，癥狀明顯加重，皮膚改變的面積達(dá)19%～50%或有表面硬化癥特征，口腔黏膜中度受損并在一定程度上影響進(jìn)食，丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶或天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶為正常上限值的2～5倍，體重減輕5%～15%，關(guān)節(jié)僵硬或攣縮并輕到中度影響日常生活活動(dòng)，肺功能指標(biāo)FEV1 40%～59%或LFS 6～9，在平地走路就能感覺到呼吸困難。

1.2.4 試劑和設(shè)備(1)鼠FITC-IgG1/PE-IgG1/PE-Cy5.5-IgG1、FITC-CD45/PE-CD14、FITC-CD4、PE-CD45RA、PE-CD45RO、PE-Cy5-CD8 單克隆抗體(monocolonal antibody，McAb)購(gòu)自 Beckman-Coulter公司。紅細(xì)胞裂解液為0.83%氯化銨，洗滌液為含0.5%小牛血清的 PBS，固定液為1%多聚甲醛。(2)主要儀器是美國(guó)Becton Dickinson公司的FACSCalibur流式細(xì)胞儀。

1.2.5 檢測(cè)方法(1)留取移植后(70±3)d患者清晨空腹靜脈血2 ml，EDTA-K2抗凝。(2)抗體組合為:① FITC-IgG1/PE-IgG1/PE-Cy5.5-IgG1;②FITC-CD45/PE-CD14;③FITC-CD4/PE-CD45RA/PE-Cy5-CD8;④FITC-CD4/PE-CD45RO/PE-Cy5-CD8;(3)各檢測(cè)管中加入相應(yīng)組合的熒光素標(biāo)記的McAb 各 5 μl，再加入混勻的抗凝血 50 μl，混勻，室溫避光孵育20 min。加入溶血素2 ml，混勻，放置5～10 min，待紅細(xì)胞裂解。1 000～1 200 r/min離心5 min，棄上清液，懸浮細(xì)胞，加入PBS 2 ml，混勻，800～1 000 r/min離心5 min，棄上清液。懸浮細(xì)胞，加入固定液 300 μl，混勻，放置 2℃～8℃ 避光處，24 h內(nèi)上機(jī)分析。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件包處理，各計(jì)量資料用表示。通過(guò)兩個(gè)獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)分析無(wú)cGVHD組與cGVHD組間各檢測(cè)指標(biāo)有無(wú)差異，如P＜0.05認(rèn)為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;進(jìn)一步應(yīng)用單因素方差分析對(duì)各組均數(shù)做顯著性檢驗(yàn)，如多組比較有顯著性差異，再采用q檢驗(yàn)作樣本之間的兩兩比較，P＜0.05認(rèn)為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 與未發(fā)生cGVHD相比，cGVHD患者外周血中CD4+CD45RA+細(xì)胞百分比均明顯降低(P＜0.05)，CD4+CD45RO+細(xì)胞百分比均明顯增高(P＜0.05)。CD8+CD45RA+和CD8+CD45RO+細(xì)胞百分比均無(wú)明顯改變，見表1。

2.2 輕、中、重度cGVHD組分別與未發(fā)生cGVHD組比較，CD4+CD45RA+細(xì)胞百分比均明顯低于未發(fā)生cGVHD組(P＜0.05)，CD4+CD45RO+細(xì)胞百分比均明顯高于未發(fā)生cGVHD組(P＜0.05)。CD8+CD45RA+和CD8+CD45RO+細(xì)胞百分比均無(wú)明顯改變。不同程度(輕、中、重度)的cGVHD之間比較，CD4+CD45RA+、CD4+CD45RO+、CD8+CD45RA+和CD8+CD45RO+細(xì)胞百分比均無(wú)明顯改變，見表2。

表1cGVHD組和無(wú)cGVHD組外周血CD4+CD45RA+，CD4+CD45RO+，CD8+CD45RA+和CD8+CD45RO+檢測(cè)結(jié)果(%，)Tab.1 Determination results of CD4+CD45RA+，CD4+CD45RO+，CD8+CD45RA+and CD8+CD45RO+in peripheral blood of non-cGVHD and cGVHD(%，)

表1cGVHD組和無(wú)cGVHD組外周血CD4+CD45RA+，CD4+CD45RO+，CD8+CD45RA+和CD8+CD45RO+檢測(cè)結(jié)果(%，)Tab.1 Determination results of CD4+CD45RA+，CD4+CD45RO+，CD8+CD45RA+and CD8+CD45RO+in peripheral blood of non-cGVHD and cGVHD(%，)

Note:Compared with non-cGVHD group，1)P ＜0.05.

Groups n CD4+CD45RA+ CD4+CD45RO+ CD8+CD45RA+ CD8+CD45RO +Non-cGVHD 21 50.29±13.62 68.52±14.71 83.82±82.47±9.20 50.13±15.91 7.93 47.34±12.90 cGVHD 33 37.29±13.471) 82.60±13.701)

表2 輕、中、重度 cGVHD各組和無(wú) cGVHD組外周血 CD4+CD45RA+、CD4+CD45RO+、CD8+CD45RA+和 CD8+CD45RO+檢測(cè)結(jié)果(%，)Tab.2 Determination results of CD4+CD45RA+，CD4+CD45RO+，CD8+CD45RA+and CD8+CD45RO+in peripheral blood of non-cGVHD and cGVHD within different grade(%，)

表2 輕、中、重度 cGVHD各組和無(wú) cGVHD組外周血 CD4+CD45RA+、CD4+CD45RO+、CD8+CD45RA+和 CD8+CD45RO+檢測(cè)結(jié)果(%，)Tab.2 Determination results of CD4+CD45RA+，CD4+CD45RO+，CD8+CD45RA+and CD8+CD45RO+in peripheral blood of non-cGVHD and cGVHD within different grade(%，)

Note:Compared with non-cGVHD group，1)P ＜0.05.

Groups n CD4+CD45RA+ CD4+CD45RO+ CD8+CD45RA+ CD8+CD45RO +Non-cGVHD 21 50.29±13.62 68.52±14.71 83.82±80.55±15.82 55.44±8.45 7.93 47.34±12.90 Light cGVHD 15 36.96±12.651) 80.50±10.811) 83.14±10.30 53.10±19.01 Mide cGVHD 18 38.16±14.791) 82.27±6.151) 83.10±15.39 45.87±15.54 Severe cGVHD 10 35.15±13.441) 86.05±11.481)

3 討論

GVHD是allo-HSCT后在受者體內(nèi)植活的供者淋巴細(xì)胞對(duì)宿主器官發(fā)生的以免疫性損傷為主要特征的免疫性疾病。GVHD的發(fā)生率和嚴(yán)重程度與主要組織相容性抗原的相合程度，移植物中T淋巴細(xì)胞數(shù)量的關(guān)系最為密切。由于主要組織相容性抗原的復(fù)雜性和多態(tài)性，絕大多數(shù)造血干細(xì)胞移植是在不完全相合的情況下進(jìn)行的，其GVHD的發(fā)生率達(dá)70%，GVHD的相關(guān)死亡率占移植死亡的50%以上［3］?？梢奊VHD的發(fā)生幾率很高，預(yù)后也很差。而臨床對(duì)于GVHD的診斷仍停留在疾病的發(fā)病過(guò)程中，沒(méi)有一項(xiàng)獨(dú)立的實(shí)驗(yàn)室預(yù)測(cè)指標(biāo)能有效診斷GVHD的發(fā)生。為此，我們對(duì)64例異基因造血干細(xì)胞移植患者進(jìn)行回顧性分析，分析無(wú)cGVHD組與cGVHD組間CD45RA+和CD45RO+T細(xì)胞的變化，以了解 CD45RA+和 CD45RO+T細(xì)胞亞群與cGVHD發(fā)生之間的關(guān)系。

CD45RA和CD45RO是CD45(白細(xì)胞共同抗原)的2種異型，均屬Ⅰ型跨膜蛋白，廣泛存在于白細(xì)胞表面，其胞漿均具有酪氨酸磷酸酶活性，在淋巴細(xì)胞的發(fā)育成熟、功能調(diào)節(jié)及信號(hào)傳遞中具有重要意義。根據(jù)CD45亞型的表達(dá)與否，可以大致將人的T細(xì)胞分為初始型T細(xì)胞(CD45RA+T細(xì)胞)和記憶性T細(xì)胞(CD45RO+T細(xì)胞)。初始型T細(xì)胞與記憶性T細(xì)胞的功能有所不同。CD45RA+的初始型T細(xì)胞不分泌IFN-γ、IL-4或IL-5，只產(chǎn)生低水平的IL-2，具有抑制免疫的作用［4］。而CD45RO+記憶性T細(xì)胞可以分泌IL-2、IL-4或IFN-γ等多種細(xì)胞因子，當(dāng)再一次接觸同一抗原刺激時(shí)，其活化閾值更低，有較強(qiáng)的效應(yīng)功能［5］。有一項(xiàng)免疫缺陷鼠(無(wú)脾、淋巴結(jié)和黏膜淋巴組織)移植模型研究顯示，只要幾千個(gè)同種反應(yīng)性記憶性T細(xì)胞向移植物遷移，就能介導(dǎo)移植排斥反應(yīng)［6］。

人類身體中存在相當(dāng)數(shù)量的CD45RO+T細(xì)胞，即同種反應(yīng)性記憶性T細(xì)胞。這種細(xì)胞的產(chǎn)生是由于暴露在同種抗原下，比如妊娠、輸血或早先的器官移植。然而，這種CD45RO+同種反應(yīng)性記憶性T細(xì)胞也存在于從未接觸過(guò)外源組織的個(gè)體中［7］。此次實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示發(fā)生cGVHD患者體內(nèi)的CD4+CD45RO+T細(xì)胞明顯高于無(wú) cGVHD患者，提示CD4+CD45RO+T細(xì)胞的存在數(shù)量與移植后發(fā)生cGVHD有密切關(guān)系。我們可以推測(cè)cGVHD的發(fā)生可能是由交叉反應(yīng)性記憶性T細(xì)胞所介導(dǎo)。這類記憶性T細(xì)胞可能是早先與病毒或細(xì)菌性抗原接觸所產(chǎn)生，能識(shí)別同種抗原。它們?cè)俅谓佑|到相同的抗原后，迅速大量活化，產(chǎn)生細(xì)胞因子，發(fā)生一系列免疫反應(yīng)，攻擊正常的組織細(xì)胞，造成了器官組織功能的損害。但輕、中、重度的 cGVHD之間的CD4+CD45RO+T細(xì)胞比較無(wú)明顯變化，提示CD4+CD45RO+T細(xì)胞與病情的進(jìn)展無(wú)明顯關(guān)系。

在本研究中，CD8+亞群并未與CD4+亞群呈現(xiàn)出一致性變化。與對(duì)照組比較，發(fā)生不同程度的cGVHD患者體內(nèi)CD8+CD45RO+T細(xì)胞均無(wú)明顯變化。這可能與標(biāo)本采集時(shí)間有關(guān)。在allo-HSCT小鼠模型研究中發(fā)現(xiàn)［8］，在GVHD發(fā)生過(guò)程中有抗原特異性記憶性CD8+T細(xì)胞形成，但記憶性CD8+T細(xì)胞的數(shù)量呈現(xiàn)一定的波動(dòng)，在移植后14 d達(dá)到最高峰，28 d時(shí)開始下降。對(duì)細(xì)胞表面的凋亡相關(guān)分子表達(dá)分析提示記憶性CD8+T細(xì)胞的減少與凋亡的發(fā)生有關(guān)。以往研究也表明記憶性CD8+T細(xì)胞和記憶性CD4+T細(xì)胞的產(chǎn)生和維持途徑有所不同［9］，受多種因素制約，還需要進(jìn)一步的研究。

也有人猜測(cè)，患者通過(guò)造血干細(xì)胞移植后，CD4+CD45RA+T細(xì)胞均明顯降低，是因?yàn)樵煅杉?xì)胞移植能有效切斷患者CD4+CD45RA+T細(xì)胞的供給途經(jīng)，這種變化有利于患者的長(zhǎng)期緩解［10］。但這些理論需要更多的實(shí)驗(yàn)來(lái)證實(shí)。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，異基因造血干細(xì)胞移植后，發(fā)生cGVHD患者外周血中CD4+CD45RA+T細(xì)胞明顯減少，CD4+CD45RO+T細(xì)胞明顯增多，CD4+的同種反應(yīng)性記憶性T細(xì)胞可能對(duì)cGVHD的發(fā)生具有極其深遠(yuǎn)的意義。通過(guò)檢測(cè)CD4+CD45RO+T細(xì)胞的百分比，以及CD4+CD45RA+T細(xì)胞和CD4+CD45RO+T細(xì)胞的比例可以輔助我們判斷cGVHD的發(fā)生。

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