陳松彪 李 靜 尚 珂 郁 川 張春杰 程相朝 李銀聚 趙戰(zhàn)勤

(河南省動(dòng)物疫病與公共安全院士工作站/河南科技大學(xué)動(dòng)物疫病與公共衛(wèi)生重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，洛陽 471003)

雞白痢是由雞白痢沙門菌引起的雞的傳染病。本病特征為幼雛感染后常呈急性敗血癥，發(fā)病率和死亡率都高，成年雞感染后，多呈慢性或隱性帶菌，可隨糞便排出，因卵巢帶菌，嚴(yán)重影響孵化率和雛雞成活率。雞白痢沙門菌具有高度宿主適應(yīng)性。本菌為兩端稍圓的細(xì)長桿菌［(0.3～0.5)μm×(1～2.5)μm］，對一般堿性苯胺染料著色良好，革蘭氏陰性。細(xì)菌常單個(gè)存在，很少見到兩菌以上的長鏈。在涂片中偶爾可見到絲狀和大型細(xì)菌。本菌不能運(yùn)動(dòng)，不液化明膠，不產(chǎn)生色素，無芽胞，無莢膜，兼性厭氧。目前，雞白痢沙門菌仍是我國養(yǎng)雞業(yè)中危害嚴(yán)重的細(xì)菌之一，能造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失。國內(nèi)常采用藥物控制該菌，但同時(shí)造成了細(xì)菌耐藥性和藥物殘留等問題。此外，在實(shí)際生產(chǎn)中沒有實(shí)施嚴(yán)格的檢疫淘汰措施，使得雞群中的雞白痢陽性率仍較高。盡管許多國家逐漸使用活疫苗預(yù)防來控制沙門菌病，取得了很好的效果，但是由于雞白痢沙門菌在發(fā)達(dá)國家基本消滅且不感染人，有關(guān)它的疫苗研究報(bào)道較少，而已有的滅活疫苗的保護(hù)水平往往較低而不能產(chǎn)生堅(jiān)實(shí)的免疫力。

近年來，利用基因工程技術(shù)將強(qiáng)毒株毒力相關(guān)基因敲除構(gòu)建新型減毒沙門菌作為疫苗的研究備受關(guān)注，通過基因工程方法減毒的沙門菌對人和動(dòng)物的致病力顯著降低，但仍然保持良好的安全性和免疫原性［1-3］。同時(shí)該類減毒株能有效地刺激機(jī)體產(chǎn)生黏膜免疫、細(xì)胞免疫和體液免疫應(yīng)答，已被證明是攜帶外源基因的良好載體［4］，但是由于生存壓力，沙門菌所攜帶的真核或者原核質(zhì)粒在體內(nèi)部可能穩(wěn)定的存在，且質(zhì)粒攜帶的抗性基因可能給動(dòng)物安全帶來了潛在性的威脅，近年來發(fā)展出來的宿主平衡致死的方法能有效解決質(zhì)粒攜帶外源基因表達(dá)不穩(wěn)定性的問題，運(yùn)用asd(天冬氨酸-β半乳糖脫氫酶)基因平衡致死系統(tǒng)，asd缺失菌株在無外源DAP(二氨基庚二酸)存在的條件下會發(fā)生死亡，質(zhì)粒載體中含有asd基因，與宿主菌Δasd缺失株表型互補(bǔ)，使重組菌在無外源DAP存在的條件下仍能存活［5］，C79-13Δcrp由筆者所在的實(shí)驗(yàn)室程相朝等在C79-13基礎(chǔ)上構(gòu)建的減毒株［6］，與親本株相比其毒力大大降低。對于crp基因的特性、功能作用等方面的研究雖然在國內(nèi)外一些沙門菌研究中有一定的報(bào)道，但有關(guān)雞白痢沙門菌C79-13ΔcrpΔasd缺失株平衡致死載體系統(tǒng)的研究目前尚未見有相關(guān)報(bào)道。本研究旨在C79-13Δcrp的基礎(chǔ)上構(gòu)建減毒雞白痢沙門C79-13ΔcrpΔasd缺失株平衡致死載體系統(tǒng)，研究其生物學(xué)特性，進(jìn)而為研發(fā)更加安全有效的雞白痢弱毒疫苗以及開發(fā)以雞白痢沙門菌C79-13為載體的多價(jià)疫苗奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 菌株和質(zhì)粒 雞白痢沙門菌C79-13強(qiáng)毒株購自中國獸醫(yī)藥品監(jiān)督所，無抗性原核表達(dá)載體pYA3493(asd+，pBRori，β-lactamase signal sequence)及其宿主菌χ6097(araΔ(lac-pro)rPslΔasdA4Δ［zhf-2::Tn10］thiф80d/lacZΔM15) 質(zhì)粒由美國華盛頓大學(xué)Dr.Roy Curtiss III教授惠贈，減毒雞白痢沙門菌C79-13Δcrp、含缺失315 bp的重組自殺性質(zhì)粒由筆者所在的實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建并保存。

1.2 主要試劑和培養(yǎng)基 各種生化鑒定試劑購自杭州天和微生物試劑有限公司;沙門菌屬診斷血清(11種)及各種單因子血清購自寧波天潤生物藥業(yè)有限公司;蔗糖、DAP購自美國Sigma-Aldrich公司;Taq DNA 聚合酶、dNTPs、DNA Marker、T4 DNA Ligase和各種限制性內(nèi)切酶均購自寶生物工程(大連)有限公司;麥芽糖、Amp、Cm、DAP、細(xì)菌基因組 DNA提取試劑盒購自北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限公司;質(zhì)粒小量提取試劑盒購自美國MOBIO Laboratories公司;DNA膠回收試劑盒購自臺灣Geneaid Biotech公司;麥康凱瓊脂和SS瓊脂培養(yǎng)基購自廣東環(huán)凱微生物科技有限公司;胰蛋白胨、酵母浸出物等購自英國OXOID公司。

1.3 培養(yǎng)條件和抗生素濃度 大腸桿菌和雞白痢沙門菌在各種培養(yǎng)基中37℃靜止或振搖培養(yǎng)，根據(jù)需要加入終濃度25 μg/ml的氯霉素(Chloram-phenicol，Cm)，50 μg/ml的二氨基庚二酸(D L-α，ε-Diaminopimelic acid，DAP)。

1.4 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 1日齡健康羅曼雛雞，按常規(guī)方法檢測均為沙門菌抗體陰性。

1.5 引物的設(shè)計(jì)和合成 根據(jù)GenBank上已公布的雞白痢沙門菌LT2(GenBank No.AE008859)及相關(guān)文獻(xiàn)設(shè)計(jì)相關(guān)引物［7］，各引物由生工(上海)有限公司合成，見表1。

1.6 接合轉(zhuǎn)移和ΔcrpΔasd缺失株的篩選 根據(jù)文獻(xiàn)［5］的方法，二步法篩選基因缺失突變株。以減毒雞白痢沙門菌C79-13Δcrp為受體菌，χ7213(pREΔasd)為供體菌進(jìn)行接合轉(zhuǎn)移。供體菌和受體菌分別培養(yǎng)過夜，各取100 μl菌懸液混合，補(bǔ)充含有DAP的LB液體培養(yǎng)液1 ml，培養(yǎng)過夜，取適量菌液涂布于含Cm和5%蔗糖的LB固體平板上培養(yǎng)，挑取Cm抗性(Cmr)蔗糖敏感(SUCs)菌落，用引物Pa5/Pa6擴(kuò)增鑒定，同時(shí)設(shè)供體菌和受體菌對照。陽性接合子在含5%蔗糖無抗性無NaCl的含有DAP的LB(NB)液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)過夜，連續(xù)10倍稀釋，選取合適的稀釋度涂布于含有DAP的LB固體平板，篩選ΔcrpΔasd缺失菌株。將細(xì)菌劃線接種于含氯霉素的LB固體平板中檢測其抗性，進(jìn)一步提取陽性缺失菌株基因組，用引物Pa5/Pa6、Pa6/Pa7 PCR擴(kuò)增鑒定，并將引物Pa6/Pa7進(jìn)行PCR擴(kuò)增產(chǎn)物送生工生物工程(上海)有限公司進(jìn)行序列測定。

表1 PCR擴(kuò)增所用的引物序列Tab.1 Primer sequences for PCR amplification

1.7 ΔcrpΔasd缺失株的表型鑒定 將Δasd缺失株進(jìn)行血清型鑒定，同時(shí)將缺失株C79-13ΔcrpΔasd與親本株C79-13Δcrp劃線接種于含和不含1%麥芽糖的麥康凱平板，然后將細(xì)菌轉(zhuǎn)接至葡萄糖、蔗糖、甘露醇、阿拉伯糖等生化鑒定管研究其生化特性情況。

1.8 ΔcrpΔasd缺失株遺傳穩(wěn)定性測定 將缺失株C79-13ΔcrpΔasd于含DAP的LB培養(yǎng)基中連續(xù)傳代60代，挑取第 10、20、30、40、50、60 代單菌落，用Pa7/Pa6引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增鑒定，以研究asd缺失基因在Δasd缺失株中的遺傳穩(wěn)定性。

1.9 ΔcrpΔasd缺失株的基因互補(bǔ)試驗(yàn) 將表達(dá)asd基因的空載體pYA3493電轉(zhuǎn)入C79-13ΔcrpΔasd缺失株，看重組菌株在無DAP的LB培養(yǎng)基中能否生長，以及在體外連續(xù)傳代培養(yǎng)看互補(bǔ)質(zhì)粒能否穩(wěn)定存在。以研究ΔcrpΔasd缺失株作為載體攜帶外源質(zhì)粒的穩(wěn)定性。

1.10 ΔcrpΔasd缺失株的生長特性鑒定 缺失株C79-13ΔcrpΔasd與親本株 C79-13、C79-13Δcrp 分別在含DAP和不含DAP的LB中37℃培養(yǎng)過夜，無菌生理鹽水連續(xù)10倍稀釋，取100 μl適當(dāng)稀釋度菌液均勻涂布于含DAP和不含DAP的LB固體平板上，每個(gè)稀釋度做3個(gè)重復(fù)，37℃培養(yǎng)過夜，計(jì)數(shù)，取平均值計(jì)算原液的CFU。然后以終濃度約為106CFU/ml轉(zhuǎn)接于相同液體培養(yǎng)基，37℃、200 r/min培養(yǎng)，每1 h取樣并進(jìn)行涂板計(jì)數(shù)，繪制生長曲線。

1.11 ΔcrpΔasd(PYA3493)缺失株的毒力測定 缺失株C79-13ΔcrpΔasd(PYA3493)與親本株 C79-13在LB液體培養(yǎng)基中37℃培養(yǎng)過夜，按1.9所述方法平板計(jì)數(shù)并計(jì)算攻毒劑量，無菌生理鹽水連續(xù)10倍稀釋，選取合適的稀釋度，每個(gè)稀釋度口服感染10只1日齡羅曼雛雞，每只500 μl，觀察直至無雛雞死亡，同時(shí)設(shè)生理鹽水空白對照組。將死亡雛雞肝臟無菌接種SS和含有1%麥芽糖的麥康凱固體平板，用引物pi1/pi2進(jìn)行PCR擴(kuò)增鑒定，記錄死亡情況，根據(jù)Bliss法計(jì)算菌株對雛雞半數(shù)致死量(LD50)。

2 結(jié)果

2.1 缺失菌株C79-13ΔcrpΔasd的篩選和鑒定 大腸桿菌 χ7213(pREΔasd)與雞白痢沙門菌 C79-13Δcrp接合轉(zhuǎn)移后發(fā)生第一次同源臂間的單交換，用asd一條上臂內(nèi)部引物Pa5和一條下臂內(nèi)部引物Pa6擴(kuò)增子，得到約為1 803 bp和315 bp兩條帶(見圖1A)。陽性接合子呈Cm抗性，但同時(shí)對蔗糖敏感。由于自殺性質(zhì)粒 pREΔasd被整合到 C79-13Δcrp染色體上，asd就有兩個(gè)拷貝，出現(xiàn)缺失型大小和野生型大小兩條帶。pREΔasd含有負(fù)向選擇基因(sacB蔗糖敏感基因)，陽性接合子在5%蔗糖無抗性無NaCl含DAP的LB(NB)培養(yǎng)基連續(xù)傳代培養(yǎng)中發(fā)生第二次同源重組，用引物Pa5/Pa6擴(kuò)增產(chǎn)生兩種結(jié)果，一種是突變型大小為315 bp，一種是恢復(fù)野生型大小為1 803 bp(見圖1)。為了進(jìn)一步證明該同源重組是發(fā)生在C79-13Δcrp的染色體而不是重組自殺性質(zhì)粒上，用asd一條下臂內(nèi)部引物Pa6和一條上臂以外染色體上的引物Pa7對陽性缺失株進(jìn)行PCR鑒定，同樣有兩種結(jié)果，缺失菌株擴(kuò)增出2 229 bp片段，野生型擴(kuò)增出 3 717 bp片段，而pREΔasd無任何條帶(見圖1B)。此時(shí)，缺失菌株呈Cm敏感和蔗糖抗性。序列測定結(jié)果也與理論預(yù)測相一致，這表明缺失菌株構(gòu)建成功，將此缺失菌株命名為 C79-13ΔcrpΔasd。

圖1 PCR鑒定缺失菌株C79-13ΔcrpΔasdFig.1 PCR identification of C79-13ΔcrpΔasd mutant

2.2 缺失株C79-13ΔcrpΔasd的表型鑒定 血清型鑒定表明，缺失株C79-13ΔcrpΔasd的血清型沒有變化，單因子血清型鑒定仍為O9型。生化鑒定結(jié)果表明，缺失株C79-13ΔcrpΔasd的生化特性與親本株C79-13相比，發(fā)生了明顯的變化。

2.3 缺失株C79-13ΔcrpΔasd遺傳穩(wěn)定性測定 缺失株C79-13ΔcrpΔasd在含DAP的LB固體平板上連續(xù)培養(yǎng)60代，應(yīng)用引物Pa7/Pa6 PCR擴(kuò)增鑒定第10、20、30、40、50、60 代的單菌落，都能得到缺失型的2 229 bp的Δasd片段(圖2)，這表明缺失株C79-13ΔcrpΔasd能夠穩(wěn)定遺傳缺失1 488 bp的asd基因片段。

2.4 C79-13ΔcrpΔasd缺失株的基因互補(bǔ)試驗(yàn) 將空載體PYA3493電轉(zhuǎn)化到C79-13ΔcrpΔasd感受態(tài)中，篩選出來的陽性重組子在LB固體平板上能夠生長，說明PYA3493能表達(dá)asd基因，并且重組菌株在LB固體平板上連續(xù)培養(yǎng)30代不丟失，此載體能夠在雙缺失株中穩(wěn)定存在。

2.5 缺失菌株C79-13ΔcrpΔasd生長特性鑒定C79-13ΔcrpΔasd、C79-13ΔcrpΔasd(PYA3493) 分別涂布含DAP和不含DAP及10 g/L麥芽糖的麥康凱平板，C79-13涂布含10 g/L麥芽糖的麥康凱平板，培養(yǎng)24 h后，平均菌落直徑是0.5、1.0、1.24 mm。以106CFU/ml的初始菌液濃度進(jìn)行培養(yǎng)，每隔1 h取樣，平板計(jì)數(shù)。以取樣時(shí)間為橫軸，以每小時(shí)所測菌落的對數(shù)值為豎軸繪制三種細(xì)菌的生長曲線(如圖3)。結(jié)果表明，缺失菌株 C79-13ΔcrpΔasd的生長速度明顯低于強(qiáng)毒株C79-13，而C79-13ΔcrpΔasd(PYA3493)和C79-13ΔcrpΔasd生長速度相差不大。

2.6 缺失菌株C79-13ΔcrpΔasd的毒力測定 雛雞經(jīng)親本菌株C79-13口服感染后，發(fā)生死亡。但無菌生理鹽水和空白對照組雛雞均未發(fā)生死亡。引物pi1/pi2均能從死亡雛雞分離的細(xì)菌擴(kuò)增出約580 bp的特異性DNA條帶(見圖4)，剖檢死亡雛雞具有典型沙門菌病變。這表明感染雛雞的細(xì)菌是沙門菌。應(yīng)用Bliss法計(jì)算(見表2)，C79-13的口服感染 LD50為1.9×106CFU，缺失菌株 C79-13ΔcrpΔasd(PYA3493)口服感染LD50為1.7×109CFU，其毒力與親本菌株C79-13相比下降了近99.9%。這表明缺失菌株C79-13ΔcrpΔasd與親本菌株 C79-13相比毒力明顯降低。

表2 缺失菌株C79-13ΔcrpΔasd與親本菌株C79-13的生化特性比較Tab.2 Comparison of biological characterization between C79-13ΔcrpΔasd mutant and C79-13

表3 缺失菌株C79-13ΔcrpΔasd和C79-13的毒力測定Tab.3 Mortality of chick infection with C79-13ΔcrpΔasd or C79-13 strain

圖2 PCR鑒定缺失菌株C79-13ΔcrpΔasd的穩(wěn)定性Fig.2 PCR identification of stability of C79-13ΔcrpΔasd mutant

圖 3 缺失菌株C79-13ΔcrpΔasd，C79-13ΔcrpΔasd(PYA3493)與CFU生長曲線Fig.3 Growth curves of C79-13ΔcrpΔasd，C79-13ΔcrpΔasd(PYA3493)and C79-13 base on CFU

圖4 沙門菌的PCR擴(kuò)增鑒定Fig.4 PCR identification of Salmonella

3 討論

雞白痢沙門菌是養(yǎng)雞業(yè)中引起嚴(yán)重危害的細(xì)菌之一，能造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失。國內(nèi)常采用藥物控制該菌，但同時(shí)也造成了細(xì)菌耐藥性和藥物殘留等問題［8］。此外，在實(shí)際生產(chǎn)中也沒有實(shí)施嚴(yán)格的檢疫淘汰措施，使得雞群中的陽性率仍較高。最近幾年，許多國家逐漸轉(zhuǎn)向使用疫苗預(yù)防來控制其他沙門菌病，取得了很好的效果［9］，由于雞白痢沙門菌不感染人，其研究報(bào)道并不多，而針對雞白痢的疫苗控制的報(bào)道卻較少。在我國現(xiàn)有的飼養(yǎng)條件下，對雞白痢的疫苗免疫值得我們嘗試。

近年來，利用基因工程構(gòu)建減毒沙門菌作疫苗的研究備受關(guān)注，減毒活疫苗比滅活疫苗和亞單位疫苗在預(yù)防控制沙門菌病方面更有優(yōu)勢。通過傳統(tǒng)的抗生素誘導(dǎo)或化學(xué)誘導(dǎo)獲得的弱毒株，存在毒力不穩(wěn)定容易返強(qiáng)的潛在危險(xiǎn)。目前減毒鼠沙門菌作為疫苗載體的效果和安全性已被大量的動(dòng)物和人體試驗(yàn)所證實(shí)［10］。減毒沙門菌既可以作為疫苗株，又可以作為運(yùn)送載體表達(dá)外源基因。同時(shí)，攜帶外源基因的減毒菌可以通過自然感染途徑，如口服或鼻內(nèi)接種，引起動(dòng)物較強(qiáng)的黏膜免疫應(yīng)答，具有操作簡單、對動(dòng)物損傷小等優(yōu)點(diǎn)。因此，近年來，以減毒沙門菌作為活疫苗表達(dá)載體的研究已成為一個(gè)熱點(diǎn)。黏膜免疫與多價(jià)疫苗是未來免疫預(yù)防的重要方向，以細(xì)菌為載體的重組活疫苗被認(rèn)為是最有前景的研究領(lǐng)域之一。

質(zhì)粒平衡致死載體系統(tǒng)是解決外源質(zhì)粒不能穩(wěn)定遺傳的有效途徑。asd基因編碼的天冬氨酸β-半乳糖脫氫酶是DAP生物合成途徑中的必需酶，而DAP是革蘭氏陰性菌細(xì)胞壁主要化學(xué)成分肽聚糖四肽側(cè)鏈的一個(gè)組分，asd突變株在無外源DAP條件下不能形成完好的細(xì)胞壁，最終溶菌死亡。同時(shí)，由于哺乳動(dòng)物組織中不含DAP，因此，突變菌在動(dòng)物體內(nèi)均被降解。質(zhì)粒PYA3493是含有asd基因的表達(dá)質(zhì)粒，可攜帶外源基因轉(zhuǎn)化本研究構(gòu)建的C79-13ΔcrpΔasd，質(zhì)粒上的asd基因可與突變菌形成互補(bǔ)，從而解決了突變菌不能在DAP陰性環(huán)境中生存的問題。crp基因編碼cAMP受體蛋白，其突變株影響碳水化合物的合成及菌毛和鞭毛的合成。郁川等［10］指出，crp基因是沙門菌的重要毒力基因之一，缺失crp基因可明顯降低沙門菌的毒力，但仍保留了其免疫原性。

本研究以缺失了crp基因的雞白痢沙門菌C79-13為受體菌，降低了C79-13的毒力，消除了毒力返強(qiáng)的風(fēng)險(xiǎn)，然后與χ7213(pREΔasd)接合轉(zhuǎn)移，成功構(gòu)建了asd基因突變株，并與含asd基因的質(zhì)粒PYA3493形成營養(yǎng)互補(bǔ)，用于高效表達(dá)外源基因。生物學(xué)特性研究表明缺失菌株C79-13ΔcrpΔasd不能再利用麥芽糖、甘露醇等部分碳源，但仍能利用葡萄糖和果糖作為碳源物質(zhì)，這與 Rosu［11］利用轉(zhuǎn)座子構(gòu)建的雞白痢沙門菌crp缺失菌株相一致。其生長速度與親本菌相比發(fā)生了明顯的變化，其能穩(wěn)定遺傳缺失了的asd基因，其毒力與親本相比發(fā)生了顯著的降低。

綜上所述，本研究成功構(gòu)建了雞白痢沙門菌C79-13株ΔcrpΔasd缺失株平衡致死載體系統(tǒng)，并對其生物學(xué)特性進(jìn)行了一系列的研究。該系統(tǒng)在無外源選擇壓力的條件下能夠穩(wěn)定遺傳asd基因，并且外源質(zhì)粒PYA3493能夠穩(wěn)定存在于該系統(tǒng)中，這與張明亮等報(bào)道的豬霍亂沙門菌［12］的結(jié)果一致，能夠克服以往外源基因不穩(wěn)定遺傳的問題，同時(shí)，該系統(tǒng)沒有任何抗生素基因的標(biāo)記，不會產(chǎn)生生物安全的問題，并且這為將雞白痢沙門菌C79-13突變株開發(fā)成安全高效的疫苗活載體奠定了基礎(chǔ)。然而減毒雞白痢沙門菌作為疫苗，由于具有宿主特異性，不能傳染給人，這是其他非宿主特異性沙門菌所不具備的，然而要想成為一株理想的疫苗候選株還有許多問題需要解決，這還需要我們進(jìn)一步的臨床試驗(yàn)。

［1］焦新安，潘志明，倪振亞，等.減毒雞沙門菌安全性和免疫效力初步研究［J］.中國畜禽傳染病，1998，20(5):265-267.

［2］潘志明，焦新安，趙 霞，等.減毒雞沙門氏菌97A疫苗株安全性和免疫效力試驗(yàn)［J］.中國獸醫(yī)雜志，2001，37(5):12-14.

［3］劉海峽，王寶安，潘志明，等.減毒雞沙門菌疫苗株97A的免疫保護(hù)效力試驗(yàn)［J］.動(dòng)物醫(yī)學(xué)進(jìn)展，2006，27(4):75-79.

［4］HU RJ，LEE JH.Enhancement of immuno responses by an attenuated Salmonella entherica serovar typhimurium Strain secreating an Escherichia coli heat-labile enterotoxin Bsubunitp protein as an adjuvant for alive Salmonella vaccine candidate ［J］.Clin Vaccine Immuno，2011，18(2):203-209.

［5］徐引第，郭愛珍，劉淮紅，等.豬霍亂沙門菌C500株Δcrp-Δasd缺失株平衡致死載體系統(tǒng)的構(gòu)建及鑒定［J］.生物工程學(xué)報(bào)，2006，22(3):366-372.

［6］程相朝，郁 川，廖成水，等.減毒雞白痢沙門菌ΔcrpC79-13株的構(gòu)建及其對雛雞的免疫活性［J］.中國獸醫(yī)科學(xué)，2012，42(1):19-25.

［7］Edwards RA，Keller LH，Schifferli DM，et al.Improved allelic exchange vectors and their use to analyze 987P fimbriae gene expression［J］.Gene，1998，207(2):149-157.

［8］Kang HY，Dozois CM，Tinge SA，et al.Transduction-mediated transfer of unmarked deletion and point mutations through use of counterselectable suicide vectors［J］.Bacteriol，2002，184(1):307-312.

［9］Diltis DA，Riesenfeld OI，F(xiàn)ulginiti JP，et al.phase clinical trials of aroA aroD and htrA attenuated s.Tyhi vaccines:effect of formulation on safety and immuno genicity［J］.Vaccine，2000，18(15):1531-1564.

［10］郁 川，程相朝，趙戰(zhàn)勤，等.豬霍亂沙門氏菌C78-1株Δcrp缺失株的構(gòu)建及其生物學(xué)特性初步研究［J］.畜牧獸醫(yī)學(xué)報(bào)，2010，41(5):587-593.

［11］Rosu V，Chadfield MS，Santona A，et al.Effects of crp deletion in Salmonella enterica serotype Gallinarum ［J］.Acta Vet Scand，2007，49:14.

［12］張明亮，張春杰，程相朝，等.豬霍亂沙門氏菌 C78-1株ΔcrpΔasd缺失株平衡致死載體系統(tǒng)的構(gòu)建及生物學(xué)特性研究［J］.中國獸醫(yī)科學(xué)，2012，42(4):373-379.