馮繼紅 傅仲學 文坤明 張壽儒 盧偉東 王 昊 吳星燁

(重慶醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院胃腸外科，重慶 400016)

結直腸癌是威脅人類健康的主要惡性腫瘤之一，在全球范圍內(nèi)每年新發(fā)病例120萬例，死亡達60萬例［1，2］。目前結直腸癌在我國消化系統(tǒng)惡性腫瘤中列第2位，其發(fā)病和死亡呈逐年上升趨勢，且發(fā)病年齡有所提前［3］。隨著結直腸癌分子生物學發(fā)病機制研究的深入，特定分子靶向治療顯示出極大的臨床應用前景。

過氧化還原蛋白酶2(Peroxiredoxin2，Prdx2)是一種新近發(fā)現(xiàn)的分子量在20～30 kD的過氧化物酶家族成員之一，廣泛分布于生物有機體內(nèi)，在哺乳動物組織細胞和亞細胞器中廣泛分布但又存在差異性。Prdx2功能多樣，具有抗氧化還原、介導細胞信號轉導、參與調(diào)節(jié)細胞周期及凋亡、調(diào)控免疫反應和發(fā)揮分子伴侶等功能。近年研究表明，Prdx2在多種腫瘤組織中表達，作為抑癌或促癌因子發(fā)揮重要作用［4，5］。我們前期實驗結果發(fā)現(xiàn)，Prdx2 在結直腸癌組織及細胞中表達明顯較高，提示Prdx2可能與結直腸癌的發(fā)展與轉移關系密切［6］。本實驗通過構建Prdx2基因的慢病毒表達載體，同時包裝高滴度慢病毒顆粒并轉染結直腸癌SW480，篩選建立穩(wěn)定高表達Prdx2的SW480細胞株，同時檢測Prdx2在mRNA和蛋白水平的表達情況，并初步研究轉染Prdx2慢病毒表達載體的SW480細胞的增殖及生長變化，為進一步探討Prdx2基因?qū)Y直腸癌SW480細胞生物學行為的影響及其分子機制奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 主要試劑和儀器 人結直腸癌SW480細胞株，購于中國生命科學院上海生命科學研究院細胞庫。Ubi-MCS-EGFP-IRES-Puromycin Vector(GV218載體)、AgeⅠ/AgeⅠ酶切、增強劑 Eni.S、polybrene(上海吉凱基因);Lipofectamine 2000(Invitrogen);In-FusionTMPCR Cloning Kit(clontech);Plasmid抽提Kit(QIAGEN);限制性內(nèi)切酶、T4 DNA ligase(NEB);Taq polymerase(SinnBio);DNA Ladder(Fermentas);dNTP Mix(TaKaRa);瓊脂糖(賽百盛公司);瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒(天根生化);FBS、BSA(上海微科生化試劑);DMEM、Leibovitz’s L-15培養(yǎng)基(Gibco);蛋白裂解液RIPA和蛋白酶抑制劑PMSF(上海生物試劑廠);BCA蛋白含量試劑盒(凱基生物);PRDX2鼠抗人抗體(Abcam);GAPDH、HRP標記鼠二抗均購于(Santa Cruz);PCR儀(Applied Biosystems);Positive clone測序(美季生物技術);低溫臺式高速離心機和二氧化碳培養(yǎng)箱(Thermo);IX-51倒置顯微鏡和IX-71倒置熒光顯微鏡(Olympus)。

1.2 慢病毒載體的構建及鑒定 以Prdx2全長克隆(NM_005809)為模板擴增其編碼框序列，設計Prdx2基因引物序列，Prdx2正向引物序列為:GAG GAT CCC CGG GTA CCG GTC GCC ACC ATG GCC TCC GGT AAC GC;Prdx2反向引物序列為:TCA CCA TGG TGG CGA CCG GAT TGT GTT TGG AGA AAT ATT CC，引物含交換配對堿基、酶切位點，并含有目的基因5’端部分序列用于PCR釣取目的基因。PCR方法釣取Prdx2基因后，將目的載體酶切，酶切產(chǎn)物電泳回收后交換入表達載體，其產(chǎn)物轉化細菌感受態(tài)細胞。對長出的克隆先進行菌落PCR鑒定，再對PCR鑒定陽性的克隆進行測序和比對分析，比對正確即為構建成功的目的質(zhì)粒。PCR反應條件為:94℃ 5 min;94℃ 30 s、55℃ 30 s、72℃ 2 min，30個循環(huán);72℃延伸10 min。PCR鑒定引物其正向序列Ubi-F:GGG TCA ATA TGT AAT TTT CAG TG;反向序列EGFP-N-R:CTG GTC GAG CTG GAC GGC GACG，產(chǎn)物大小:640 bp。同時設立陰性對照組(空載質(zhì)粒為模板)和陽性對照組(插入GAPDH片段的載體組)，對假陽性和假陰性結果進行排除。對PCR陽性克隆片段測序鑒定，并在GenBank數(shù)據(jù)庫中將測序出的結果進行Blast比對。

1.3 慢病毒的包裝與病毒滴度測定 制備編碼慢病毒顆粒的重組病毒質(zhì)粒及其兩種輔助包裝原件載體質(zhì)粒(GV218慢病毒載體、pHelper1.0載體和pHelper2.0載體質(zhì)粒)，三種質(zhì)粒載體分別進行高純度無內(nèi)毒素抽提，按 Invitrogen公司 Lipofectamine 2000使用說明進行共轉染293T細胞，轉染后8 h更換為完全培養(yǎng)基，培養(yǎng)48 h后，收集富含慢病毒顆粒的細胞上清液，對其濃縮后得到高滴度的慢病毒濃縮液，逐孔稀釋，滴度測定法實時定量PCR(qRTPCR)法測定其病毒滴度(TU/ml)。獲得攜帶增強綠色熒光蛋白基因(EGFP)和嘌呤霉素(Puromycin)抗性基因的Prdx2慢病毒溶液(Ubi-Prdx2-EGFP-Puromycin)以及空載對照慢病毒(分別命名為 LVPrdx2、LV-Con)，病毒液分裝后于-80℃保存。

1.4 病毒轉染SW480細胞并篩選建立穩(wěn)定表達Prdx2的細胞株 取細胞狀態(tài)良好，處于對數(shù)生長期的SW480細胞，計數(shù)后均勻接種于6孔板，分為3組:轉染組(SW480/LV-Prdx2)、空載慢病毒對照組(SW480/LV-Con)、陰性對照組(Negative control，NC)即未經(jīng)任何處理的SW480組(SW480/NC)。待細胞完全貼壁、細胞匯合率達60%左右后進行轉染，依次加入終濃度為 8 μg/ml Polybrene、Eni.S、L-15培養(yǎng)基及稀釋的標準濃度病毒液(MOI為50)，使其總體積達1 ml。轉染作用時間約28 h后更換為含有3 μg/ml嘌呤霉素(Puromycin)的新鮮L-15培養(yǎng)液進行抗性篩選，轉染至48 h后在熒光顯微鏡下觀察轉染效果。待細胞長滿后繼續(xù)在藥物選擇壓力下培養(yǎng)傳代3～4周建立SW480/LV-Prdx2穩(wěn)定高表達Prdx2細胞株。

1.5 Western blot法檢測 收集SW480/LV-Prdx2組、空載慢病毒對照(SW480/LV-Con)組、陰性對照SW480細胞(SW480/NC)組，PBS洗滌2次，離心棄上清，加入200 μl預冷的RIPA細胞裂解液，置于冰上30 min，4℃、14 000 r/min 離心 16 min，取上清并進行蛋白定量(BCA法)。取30 μg蛋白加入上樣緩沖液，經(jīng)100℃、10 min變性后用100 g/L的SDS-PAGE分離。蛋白半干轉移至PVDF膜，用含50 g/L脫脂奶粉的TBST緩沖液室溫封閉1 h，小鼠抗人Prdx2的一抗或小鼠抗人β-acin的一抗，4℃過夜，TBST洗滌3次，加入HRP標記的山羊抗小鼠二抗室溫孵育1 h，TBST洗滌3次，加入ECL顯色劑后暗室內(nèi)壓片曝光。

1.6 qRT-PCR檢測 各組細胞以Trizol法提取總RNA(按說明書操作)，瓊脂糖凝膠電泳檢測所提取RNA的完整性，逆轉錄反應合成Prdx2 cDNA，qRTPCR法擴增Prdx2和GAPDH。以各組細胞cDNA作為模板，每個組設立3個復孔。反應體系包括:2×SYBR Green Mix:10 μl，引物 Mix:1 μl ，模版:1 μl ，ddH2O:8 μl，總體系為20 μl。GAPDH 上游引物為:5’-TGA CTT CAA CAG CGA CAC CCA-3’，下游引物為:5’-CAC CCT GTT GCT GTA GCC AAA-3’;Prdx2基因上、下游引物如前。PCR的反應條件:95℃ 2 min;95℃ 20 s;60℃ 30 s，72℃ 30 s(40 個循環(huán))，反應完成后，得出Ct值，然后計算出相應Ct值，分析各組之間Prdx2基因的mRNA表達水平的差異。

1.7 MTT法檢測SW480細胞增殖抑制作用 取狀態(tài)良好，處于對數(shù)生長期各組細胞，消化后制成單細胞懸液，調(diào)整濃度為1×105ml-1，于96孔板內(nèi)均勻接種細胞，每孔加L-15培養(yǎng)基200 μl，每組設5個復孔，另設陰性對照及空白對照孔，常規(guī)培養(yǎng)，每2 d換一次液;每天固定時間向每孔加20 μl MTT，37℃孵育 4 h;每孔加 150 μl DMSO，震蕩 10 min，酶標儀490 nm測吸光度(A)值，取5孔平均值。

1.8 克隆形成實驗 取轉染組及空載對照組的SW480細胞常規(guī)消化成單細胞懸液，以300個/ml均勻接種于6孔板。在CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，2～3 d更換一次新鮮培養(yǎng)基，培養(yǎng)2～3周，待細胞生長至肉眼觀察見有明顯克隆群落時取出結晶紫染色，在倒置顯微鏡下計數(shù)大于50個細胞的克隆數(shù)并拍照。克隆形成百分率按照下列公式計算:克隆百分率=克隆數(shù)/接種數(shù)×100%。

1.9 統(tǒng)計學分析 數(shù)據(jù)采用SPSS18.0進行統(tǒng)計學分析，各組數(shù)據(jù)采用表示，各組間比較采用方差分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 慢病毒表達載體Ubi-Prdx2-EGFP-Puromycin的構建與酶切鑒定 據(jù)GV218載體(Ubi-MCS-EGFPIRES-Puromycin Vector)篩選陽性重組載體Ubi-Prdx2-EGFP-Puromycin，快速小量提取質(zhì)粒DNA，經(jīng)AgeⅠ/AgeⅠ雙酶切后得到一條明亮清晰的條帶，分子量大小約為11.1 kp，與 Ubi-Prdx2-EGFP-Puromycin片段大小一致，說明重組載體構建成功，見圖1A。目的基因Prdx2經(jīng)PCR擴增后瓊脂糖凝膠電泳酶切后的產(chǎn)物，可見在640 bp大小處有明亮清晰的條帶，與設計的克隆片段大小一致，見圖1B。

Prdx2基因產(chǎn)物純化后轉接插入載體Ubi-Prdx2-EGFP-Puromycin后純化，大腸桿菌菌株 DH5α擴增慢病毒載體和輔助包裝載體質(zhì)粒，并得到數(shù)十個克隆，挑取8個克隆(編碼為1～8號轉化子)，小量搖菌后行菌液鑒定，結果表明可擴增出約801 bp的目的片段，與目的條帶理論上大小相符的克隆可視為陽性克隆，PCR菌落篩選電泳結果見圖2。測序結果與GenBank NM_005809序列一致，說明重組載體Ubi-Prdx2-EGFP-Puromycin構建成功。

2.2 慢病毒載體的包裝與病毒滴度的測定 慢病毒載體共轉染293T細胞，于轉染48 h后在熒光顯微鏡下觀察其293T細胞發(fā)出的綠色熒光。經(jīng)測定，慢病毒載體Ubi-Prdx2-EGFP-Puromycin(LV-Prdx2)濃縮后的病毒滴度大約為2×109TU/ml，空載對照慢病毒LV-Con濃縮后的病毒滴度則為2×108TU/ml。

圖2 陽性克隆PCR鑒定Fig.2 PCR identification of recombinant containing Prdx2 gene bacteria colonies

2.3 慢病毒轉染SW480細胞后熒光表達檢測SW480細胞轉染慢病毒Ubi-Prdx2-EGFP-Puromycin(LV-Prdx2)后48 h在熒光顯微鏡下觀察其綠色熒光表達，從明光視野和熒光視野二者比較中，可見其轉染效率較高，可達95%以上(圖3)。

圖3 轉染SW480細胞48 h熒光表達檢測(熒光顯微鏡，×200)Fig.3 Fluorescent observation of EGFP expression of SW480 cells 48 hours after virus infection(Fluorescent microscope，×200)

2.4 qRT-PCR檢測 qRT-PCR檢測結果顯示，與SW480/LV-Con組、空白組 SW480細胞比較，SW480/LV-Prdx2組細胞Prdx2 mRNA高表達，差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)，見圖4。

圖4 各組SW480細胞中的Prdx2 mRNA表達Fig.4 Expression of Prdx2 mRNA in SW480 cells in three groups

2.5 Western blot法檢測 Western blot法檢測結果顯示，與陰性對照組及空載慢病毒對照(SW480/LV-Con)組相比，SW480/LV-Prdx2組細胞Prdx2蛋白呈高表達(圖5)。

圖5 Western blot法檢測LV-Prdx2轉染后SW480細胞中Prdx2的蛋白表達Fig.5 Protein expresstion of Prdx2 detected by Western blot analysis in SW480 cells transfected by LVPrdx2

2.6 Prdx2高表達對SW480細胞的促增殖作用MTT法檢測各組SW480細胞5 d OD值，繪制生長曲線，結果顯示，SW480轉染組細胞與對照組及空白組相比，生長增殖較快，差異具有顯著性(P＜0.05)(見圖6)。

圖6 MTT檢測高表達Prdx2對SW480細胞的促增殖作用Fig.6 Proliferation effect of over-expression of Prdx2 on SW480 cells by MTT

2.7 Prdx2對SW480細胞平板克隆形成能力的影響 細胞平板克隆形成實驗結果(見圖7)顯示，LVPrdx2組較空載對照組的平板克隆形成能力明顯升高(P＜0.05)。

圖7 Prdx2高表達對SW480細胞平板克隆形成能力的影響Fig.7 Effect of plate colonity in SW480 cells transfected by LV-Prdx2

3 討論

研究表明，近20%的人類癌癥是由轉染和炎癥疾病引起的，在這些疾病過程中激活的炎性細胞產(chǎn)生了大量的活性氧(Reactive oxygen species，ROS)。為了對抗ROS，細胞保護系統(tǒng)可直接破壞活性氧或是修復其造成的各種類型的損害，過氧化還原蛋白(Peroxiredoxins，Prdxs)在細胞對抗 ROS及保持胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)的過程中發(fā)揮了極為重要的作用［7］。Prdxs家族是體內(nèi)重要的抗氧化蛋白家族，廣泛存在于真核及原核生物中，哺乳動物細胞發(fā)現(xiàn)的6種Prdxs蛋白可分為3類:典型的2-半胱氨酸亞群(Prdx1～4)、非典型的2-半胱氨酸亞群(Prdx5)、1-半胱氨酸亞群(Prdx6)。Prdxs在清除ROS的過程中，自身也被氧化，隨后可通過合成新的蛋白質(zhì)或在硫氧還蛋白及其他氧化還原劑的作用下再次恢復功能［8］。

Peroxiredoxin 2(Prdx2)作為Prdxs家族重要成員之一，除發(fā)揮抗氧化功能作用外，還通過過氧化氫(H2O2)介導的細胞因子信號轉導參與細胞的增殖、分化和凋亡［8］。Prdx2與機體的生長發(fā)育、細胞衰老、免疫功能密切相關，并在維持紅細胞生存，促進NK細胞發(fā)揮自然殺傷功能的過程中扮演重要角色［9，10］。另外，近年一個重要的發(fā)現(xiàn)就是Prdx2在不同的腫瘤中異常表達，通過不同的信號通路參與了腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及轉移等。據(jù)報道，Prdx2與實體瘤如乳腺癌［11］、骨肉瘤［12］、肝癌［13］、膀胱癌［14］、前列腺癌［15］、黑色素瘤［16］等有關，是腫瘤重要生物標記物之一，但有趣的是Prdx2在乳腺癌、骨肉瘤、肝癌中其表達上調(diào)，可視為促癌因子，但在膀胱癌和黑色素瘤中表達降低，又被認為是抑癌因子，推測Prdx2在不同的腫瘤中可能通過不同的作用機制發(fā)揮調(diào)節(jié)作用。迄今為止，Prdx2在結直腸癌中的研究報道較少，我們前期實驗研究也證實Prdx2在結直腸癌組織及細胞株中表達上調(diào)，且與結直腸癌的發(fā)生、發(fā)展及轉移密切相關［6］，預測Prdx2可能在結直腸腫瘤組織中發(fā)揮更為關鍵的作用。根據(jù)本實驗結果，Prdx2對結直腸癌SW480細胞的增殖具有明顯促進作用，其作用的周期特點及涉及的分子作用機制仍需進一步深入。

綜上所述，本實驗通過構建可穩(wěn)定高表達Prdx2的重組慢病毒表達載體Ubi-Prdx2-EGFP-Puromycin，并將其轉染結直腸癌SW480細胞，篩選建立穩(wěn)定高表達Prdx2的SW480/LV-Prdx2細胞株，同時初步證實Prdx2的高表達可促進結直腸癌SW480細胞的增殖，為進一步研究Prdx2在結直腸癌中所發(fā)揮的功能及其作用機制提供實驗依據(jù)。

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