石慶麗，燕浩，陳紅燕，王凱，姚婧璠，韓在柱，張玉梅，張貴云，高玉蘋

功能磁共振成像(functional magnetic resonance imaging,fMRI)是通過測(cè)定磁共振信號(hào)變化來反映血氧飽和度及血流量?；谘跛揭蕾?blood-oxygen-level dependent,BOLD)的fMRI是目前應(yīng)用最廣泛的方法。靜態(tài)BOLD指的是受試者閉眼、放松、靜止不動(dòng)，并避免任何有結(jié)構(gòu)的思維活動(dòng)的狀態(tài)[1]。多數(shù)基于靜息態(tài)BOLD的研究表明，人腦的某些區(qū)域在不接受任何外來刺激的靜息狀態(tài)下，仍存在著有規(guī)律的活動(dòng)，這些區(qū)域構(gòu)成腦靜息狀態(tài)下的默認(rèn)網(wǎng)絡(luò)(default mode network,DMN)[2-3]。并且一項(xiàng)正電子發(fā)射體層成像(positron-emission tomography,PET)研究表明，這種默認(rèn)網(wǎng)絡(luò)僅在靜息狀態(tài)下激活，在有任務(wù)刺激時(shí)消失或激活程度降低[4]。后來又有多項(xiàng)研究表明，人腦在靜息狀態(tài)下仍存在多個(gè)腦連接網(wǎng)絡(luò)[5-9]，并且這些網(wǎng)絡(luò)之間可能存在一定的因果聯(lián)系。因此，本文就正常人腦在靜息狀態(tài)下的不同專屬性腦網(wǎng)絡(luò)之間的因果有效連接強(qiáng)度及其意義進(jìn)行研究和探討。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取北京天壇醫(yī)院門診及體檢科健康受試者36名，其中男性20名，女性16名；年齡40～65歲，平均(51.88±8.44)歲；均為右利手。所有受試者健康體檢正常，無高血壓病、糖尿病、內(nèi)科系統(tǒng)疾病等，無認(rèn)知障礙主訴，簡(jiǎn)易精神狀態(tài)檢查(Mini-Mental State Examination,MMSE)評(píng)分28～30分。所有受試者在行fMRI檢查前簽知情同意書。

1.2 方法

使用德國(guó)西門子3.0 T磁共振成像儀，將患者頭位固定，盡量避免頭部及身體其余部分的活動(dòng)，囑受試者保持清醒、閉目，盡量避免任何形式的思維活動(dòng)，對(duì)其進(jìn)行靜息態(tài)功能磁共振(resting state functional MRI,rs-fMRI)數(shù)據(jù)采集。先行軸位、失狀位T1WI、T2WI及軸位液體衰減反轉(zhuǎn)恢復(fù)序列(fluid attenuated inversion recovery,FLAIR)結(jié)構(gòu)像掃描，之后采用快速自旋回波序列采集fMRI數(shù)據(jù)。所用參數(shù)：重復(fù)時(shí)間TR(repetition time)2000.0 ms，回波時(shí)間(echo time,TE)30.0 ms，矩陣64×64；視場(chǎng)256×256 mm2，層厚3 mm，掃描時(shí)間486 s。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

所有的預(yù)處理都使用SPM 5.0軟件進(jìn)行分析處理?？紤]到磁場(chǎng)的均衡性，前5幀圖像均被去除，將剩余的所有層面的數(shù)據(jù)進(jìn)行重排，使用最小二乘化空間最小化的方法糾正頭部運(yùn)動(dòng)。在每一個(gè)層面，所有參與者頭部活動(dòng)都不超過2 mm，頭部旋轉(zhuǎn)角度不超過1°。得到的影像學(xué)數(shù)據(jù)進(jìn)一步標(biāo)準(zhǔn)化到蒙特利爾神經(jīng)病學(xué)研究所(MNI)標(biāo)準(zhǔn)頭解剖模版上，再在2×2×2 mm的空間中進(jìn)行重建。使用顳葉帶通濾過方法降低靜息狀態(tài)下低頻漂移和高頻噪聲的影響。最后，對(duì)所有圖像進(jìn)行空間平滑高斯濾過。

我們使用fMRIGift工具包對(duì)正常對(duì)照組預(yù)處理后的數(shù)據(jù)進(jìn)行空間獨(dú)立成分分析，提取并分離不同的專屬性腦網(wǎng)絡(luò)，然后提取不同專屬性腦網(wǎng)絡(luò)獨(dú)立空間成分所對(duì)應(yīng)的時(shí)間成分，作為Granger因果分析方法(Granger causality analysis,GCA)模型的輸入量，建立多變量GCA的自回歸模型。經(jīng)過獨(dú)立成分分析后，將靜息態(tài)腦網(wǎng)絡(luò)分為默認(rèn)網(wǎng)絡(luò)、記憶網(wǎng)絡(luò)(memory network,MeN)、運(yùn)動(dòng)網(wǎng)絡(luò)(motor network,MoN)、聽覺網(wǎng)絡(luò)(auditory network,AN)和執(zhí)行控制網(wǎng)絡(luò)(executive control network,ECN)5個(gè)專屬性腦網(wǎng)絡(luò)。在多維向量自回歸模型中計(jì)算這5個(gè)腦網(wǎng)絡(luò)在獨(dú)立成分分離后產(chǎn)生的相應(yīng)時(shí)間成分，并分析這些時(shí)間序列之間的因果關(guān)系。

2 結(jié)果

所有的受試者常規(guī)MRI結(jié)構(gòu)像均正常。

2.1 正常人靜息態(tài)腦網(wǎng)絡(luò)及其組成

應(yīng)用獨(dú)立成分分析(independent component analysis,ICA)方法，得到5個(gè)經(jīng)典的正常人靜息態(tài)腦網(wǎng)絡(luò)(resting-state networks,RSNs)及其所包括的核團(tuán)。

2.1.1 默認(rèn)網(wǎng)絡(luò) 這個(gè)網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)涉及到內(nèi)部的處理，它主要包括后扣帶回/楔前葉區(qū)、雙側(cè)頂下回、角回、顳中回及顳上回(圖1A)。

2.1.2 記憶網(wǎng)絡(luò) 主要負(fù)責(zé)記憶功能，它主要包括額中回、顳中回及頂上回(圖1B)。

2.1.3 運(yùn)動(dòng)網(wǎng)絡(luò) 包括中央前回、中央后回、額中回及顳中回，涉及到運(yùn)動(dòng)功能(圖1C)。

2.1.4 聽覺網(wǎng)絡(luò) 這一網(wǎng)絡(luò)包括島葉皮質(zhì)、顳中回及顳上回，主要負(fù)責(zé)聽覺處理過程(圖1D)。

2.1.5 執(zhí)行控制網(wǎng)絡(luò) 這一網(wǎng)絡(luò)主要包括前額葉皮質(zhì)上部及中部、扣帶回前部及前額葉皮層腹外側(cè)，涉及到執(zhí)行功能控制和工作記憶功能(圖1E)。

這同先前的多數(shù)研究發(fā)現(xiàn)一致。

圖1 正常人腦靜息態(tài)腦網(wǎng)絡(luò)及其包括的核團(tuán)

2.2 靜息態(tài)腦網(wǎng)絡(luò)之間的GCA分析

對(duì)正常對(duì)照組所得到的靜息態(tài)腦網(wǎng)絡(luò)，使用GCA分析方法來研究RSNs之間的因果聯(lián)系(公式1～公式3)，有效的大腦網(wǎng)絡(luò)連接模式被描述為方向圖(圖2)，其中，連接線的厚度和箭頭的方向分別表明因果影響的強(qiáng)度和方向，圖中只顯示出顯著的有效連接(P＜0.01)。

在第1個(gè)公式中，xi,t=1,2,...,5，分別代表下額葉皮質(zhì)(inferior frontal cortex,IFC)、前輔助運(yùn)動(dòng)區(qū)(presupplementary motor area,preSMA)、初級(jí)運(yùn)動(dòng)皮層(primary motor cortex,PMC)、尾狀核頭和丘腦底核(subthalamic nucleus,STN)的時(shí)間序列，xi,t和xi,t-p分別代表在時(shí)間t和時(shí)間t-p的時(shí)間序列值，p=1,2,...,k，k是向量自回歸(vector autoregressive,VAR)模型的次序。最長(zhǎng)時(shí)間滯后利用Akaike信息準(zhǔn)則來確定，它的意思是5個(gè)時(shí)間序列和回波平面成像(echo planar imaging,EPI)J的平均。在公式2中，I,j=1,2,...,5，p=1,2,...,k，它是VAR模型的線性相關(guān)系數(shù)，μi(i=1,2,...,5)是每個(gè)時(shí)間序列的殘差(預(yù)測(cè)誤差)，它被假定為符合高斯分布N(O,∑u)(Eq.2)。

如果包括時(shí)間序列x2降低了時(shí)間序列x1通過自回歸模型殘差的方差，則稱為時(shí)間序列x1被時(shí)間序列x2“Granger所致的”，我們使用F檢驗(yàn)對(duì)x1和x2序列的G-因果關(guān)系的意義。

公式3中，T代表所有時(shí)間點(diǎn)的總數(shù)，p是VAR模型的指令。如果公式3的檢驗(yàn)分析比指定的顯著性標(biāo)準(zhǔn)更大的話(如P＜0.0025，每個(gè)人共20個(gè)校正比較)，我們會(huì)把x1和x2不存在G-因果關(guān)系的零假設(shè)排除。注意，x1和x2之間相互的G-因果關(guān)系不是必要的。x1和x2的直接G-因果關(guān)系是由∑12和∑21的方差殘差決定的，這兩個(gè)詞可能不同，因?yàn)樗麄冊(cè)从趦蓚€(gè)不同的回歸假設(shè)。

圖2 正常人靜息態(tài)腦網(wǎng)絡(luò)之間的連接方向圖

如圖2所示，默認(rèn)網(wǎng)絡(luò)與記憶網(wǎng)絡(luò)、運(yùn)動(dòng)網(wǎng)絡(luò)、聽覺網(wǎng)絡(luò)和執(zhí)行控制網(wǎng)絡(luò)聯(lián)系比較密切，并且記憶網(wǎng)絡(luò)與執(zhí)行控制網(wǎng)絡(luò)之間，聽覺網(wǎng)絡(luò)與運(yùn)動(dòng)網(wǎng)絡(luò)之間，執(zhí)行控制網(wǎng)絡(luò)與聽覺網(wǎng)絡(luò)之間也存在顯著的因果聯(lián)系。

多變量GCA分析表明，默認(rèn)網(wǎng)絡(luò)與其余4個(gè)網(wǎng)絡(luò)之間，記憶網(wǎng)絡(luò)與執(zhí)行控制網(wǎng)絡(luò)之間，聽覺網(wǎng)絡(luò)與運(yùn)動(dòng)網(wǎng)絡(luò)之間，執(zhí)行控制網(wǎng)絡(luò)與聽覺網(wǎng)絡(luò)之間均存在顯著的因果聯(lián)系。

本結(jié)果表明在正常組中，默認(rèn)網(wǎng)絡(luò)是靜息狀態(tài)下的基礎(chǔ)網(wǎng)絡(luò)，因?yàn)樗梢哉蟻碜云渌鸕SNs的信息。

3 討論

3.1 功能磁共振及其應(yīng)用

fMRI是新近發(fā)展的一項(xiàng)功能影像學(xué)技術(shù)，其空間分辨率和時(shí)間分辨率較高，且不具放射性，可對(duì)同一患者重復(fù)檢查而無危險(xiǎn)性，適合神經(jīng)活動(dòng)的時(shí)空分析和腦的高級(jí)功能研究。近年來越來越多的研究將其應(yīng)用于人腦認(rèn)知功能的研究。fMRI包括擴(kuò)散、灌注成像及基于BOLD技術(shù)的功能性成像，其中BOLD是最常用的方法。BOLD是含氧和脫氧血紅蛋白的磁化率差異、神經(jīng)細(xì)胞活動(dòng)引起的血流變化、血氧濃度及代謝率變化的綜合反映。靜態(tài)BOLD指的是受試者閉眼、放松、靜止不動(dòng)，并避免任何有結(jié)構(gòu)的思維活動(dòng)的狀態(tài)[9]。一項(xiàng)基于PET的研究證實(shí)，人腦在靜息狀態(tài)下存在一種“默認(rèn)網(wǎng)絡(luò)”[10]，它負(fù)責(zé)人們?cè)诨A(chǔ)狀態(tài)下的內(nèi)省、環(huán)境警覺等內(nèi)向思維活動(dòng)。較早期的研究表明，這種默認(rèn)網(wǎng)絡(luò)區(qū)域包括內(nèi)側(cè)額葉/扣帶回前部，顳葉下方，扣帶回后部/楔前葉及后頂葉[10-11]；后來的研究發(fā)現(xiàn)，內(nèi)側(cè)顳葉區(qū)域也和這一網(wǎng)絡(luò)相關(guān)[12-13]。同時(shí)也有研究表明，人在靜息狀態(tài)下，仍存在BOLD信號(hào)的波動(dòng)，在這些自發(fā)振蕩的信號(hào)中，存在某種特定的功能連接，主要存在于運(yùn)動(dòng)系統(tǒng)、聽覺系統(tǒng)、視覺系統(tǒng)，反映了靜息狀態(tài)下人腦的活動(dòng)[9-14]。而目前研究最多的是靜息狀態(tài)及任務(wù)狀態(tài)下的腦默認(rèn)網(wǎng)絡(luò)，包括關(guān)于阿爾茨海默病[15-16]、輕度認(rèn)知障礙(mild cognitive impairment,MCI)[17-19]、正常老年人[20-21]等的研究。

本項(xiàng)對(duì)于正常人的rs-fMRI研究證實(shí)，正常人腦在靜息狀態(tài)下，存在多個(gè)腦功能激活網(wǎng)絡(luò)，其中有默認(rèn)網(wǎng)絡(luò)、運(yùn)動(dòng)網(wǎng)絡(luò)、記憶網(wǎng)絡(luò)、聽覺網(wǎng)絡(luò)和執(zhí)行控制網(wǎng)絡(luò)，這一結(jié)果證實(shí)并進(jìn)一步完善了既往的研究結(jié)論[9,14]。

3.2 靜息狀態(tài)下的腦功能連接

腦連接包括解剖連接、功能連接及有效連接，所有的腦連接構(gòu)成“腦網(wǎng)絡(luò)”[22]。腦功能連接的分析方法有種子分析方法、ICA和網(wǎng)絡(luò)圖分析法(graph network stereogram)。早期對(duì)于腦功能連接的研究，主要是通過認(rèn)知實(shí)驗(yàn)或先驗(yàn)的解剖結(jié)構(gòu)定位感興趣區(qū)，將感興趣的靜態(tài)fMRI數(shù)據(jù)作為“種子”，與其余腦區(qū)的數(shù)據(jù)做相關(guān)性分析[23-25]，得出靜息狀態(tài)下特定腦區(qū)活動(dòng)的協(xié)同一致性，即所謂的“種子分析方法”。這種方法雖然簡(jiǎn)便、敏感、易于判斷，并曾經(jīng)得到廣泛應(yīng)用，但是由于其分析結(jié)果依賴于種子區(qū)的選定，對(duì)信號(hào)內(nèi)的混雜偽跡敏感，以及不能同時(shí)對(duì)多個(gè)系統(tǒng)進(jìn)行處理，因此目前應(yīng)用減少。

ICA是一種數(shù)據(jù)驅(qū)動(dòng)的信號(hào)處理方法，近來用于檢測(cè)靜息態(tài)fMRI數(shù)據(jù)中的功能連接網(wǎng)絡(luò)[26]。ICA將信號(hào)分解成多個(gè)空間上互相獨(dú)立的成分，認(rèn)為在同一個(gè)成分上信號(hào)投影較大的腦區(qū)間存在功能連接。該方法屬于多變量分析法，其主要優(yōu)勢(shì)是直接對(duì)全腦信號(hào)進(jìn)行分析，并能分離頭動(dòng)、呼吸等噪聲對(duì)信號(hào)的影響，本文采用的是ICA。

目前源于數(shù)據(jù)的多變量向量自回歸模型，已經(jīng)被廣泛用于f MRI中人腦的功能連接的研究。它可以被用來研究靜息態(tài)下腦網(wǎng)絡(luò)之間的功能連接及單一網(wǎng)絡(luò)內(nèi)的異質(zhì)性。有研究使用GCA方法對(duì)靜息態(tài)fMRI和任務(wù)相關(guān)的數(shù)據(jù)集對(duì)腦區(qū)的功能連接進(jìn)行分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，靜息默認(rèn)網(wǎng)絡(luò)之間存在一種特定的連接模式，這種連接可以被定性為內(nèi)側(cè)前額葉皮質(zhì)和扣帶回后部皮質(zhì)的傳入和傳出的影響[27]。

研究表明，扣帶回后部皮質(zhì)和楔前葉是重要的內(nèi)部功能連接的結(jié)構(gòu)[28]，并且這個(gè)區(qū)域是早期淀粉樣沉積的部位[29]，是從外界獲取信息及對(duì)其余不同區(qū)域的信息進(jìn)行整合的重要部位[30]。有研究發(fā)現(xiàn)，隨著年齡的增長(zhǎng)，扣帶回后部/楔前葉存在明顯的連接減少，這種連接的下降和執(zhí)行功能，視空間功能及語義記憶有著密切的聯(lián)系，而與工作記憶無明確的聯(lián)系[14]，并且老年人腦在靜息狀態(tài)下內(nèi)側(cè)顳葉區(qū)域信號(hào)波動(dòng)較大，而在扣帶回后部/楔前葉區(qū)域較小，這可以用靜息狀態(tài)時(shí)對(duì)內(nèi)部信息處理過程的注意增加及對(duì)外部刺激的注意減少來解釋[14]。

本項(xiàng)研究是應(yīng)用ICA方法和GCA對(duì)靜息狀態(tài)下的腦網(wǎng)絡(luò)及其功能連接關(guān)系進(jìn)行分析，得出人腦靜息狀態(tài)下激活腦網(wǎng)絡(luò)有默認(rèn)網(wǎng)絡(luò)、記憶網(wǎng)絡(luò)、運(yùn)動(dòng)網(wǎng)絡(luò)、聽覺網(wǎng)絡(luò)和執(zhí)行控制網(wǎng)絡(luò)，而默認(rèn)網(wǎng)絡(luò)是基礎(chǔ)網(wǎng)絡(luò)，其中包括扣帶回后部/楔前葉，此處是和認(rèn)知功能密切相關(guān)的區(qū)域[14]；同時(shí)本研究也表明，靜息態(tài)下各個(gè)腦激活區(qū)之間仍存在著顯著的功能連接，而這種功能連接可能涉及到人腦在靜息狀態(tài)時(shí)對(duì)內(nèi)部信息的處理過程，因此可以推測(cè)，靜息狀態(tài)下此種功能連接的缺失可以作為預(yù)測(cè)認(rèn)知功能下降的一個(gè)支持證據(jù)，這尚需進(jìn)一步更大規(guī)模的隨訪和觀察研究來進(jìn)一步證實(shí)。

[1]Mazoyer B,Zago L,Mellet E,et al.Cortical network for working memory and executive function sustain the conscious resting statein man brain[J].Res Bull,2001,54(3):287-298.

[2]Gusnard DA,Raichle ME.Searching for a baseline:functional imaging and the resting human brain[J].Nat Rev Neurosci,2001,2(10):685-694.

[3]Hayashi T.Functional connectivity analysis of the brain network using resting-state fMRI[J].Brain Nerve,2011,63(12):1307-1318.

[4]Cordes D,Haughton VM,Arfanakis K,et al.Mapping functionally related regions of brain with functional connectivity MR imaging[J].Am JNeuroradiol,2000,21(9):1636-1644.

[5]Hampson M,Peterson BS,Skudlarski P,et al.Detection of functional connectivity using temporal correlations in MR images[J].Hum Brain Mapp,2002,15(4):247-262.

[6]Hampson M,Olson IR,Leung HC,et al.Changes in functional connectivity of human MT/V5 with visual motion input[J].Neuroreport,2004,15(8):1315-1319.

[7]Beckmann CF,DeLuca M,Devlin JT,et al.Investigations into resting-state connectivity using independent component analysis[J].Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci,2005,360(1457):1001-1013.

[8]De Luca M,Beckmann CF,De Stefano N,et al.f MRI resting state networks define distinct modes of long-distance interac-tions in the human brain[J].Neuroimage,2006,29(4):1359-1367.

[9]Fox MD,Snyder AZ,Vincent JL,et al.The human brain is intrinsically organized into dynamic,anticorrelated functional networks[J].Proc Natl Acad Sci USA,2005,102(27):9673-9678.

[10]Raichle ME,MacLeod AM,Snyder AZ,et al.A default mode of brain function[J].Proc Natl Acad Sci USA,2001,98(2):676-682.

[11]Shulman G,Fiez J,Corbetta M,et al.Common blood flow changes across visual tasks:ii.decreases in cerebral cortex[J].JCogn Neurosci.1997,9(5):648-663.

[12]Esposito F,Bertolino A,Scarabino T,et al.Independent component model of the default-mode brain function:Assessing the impact of active thinking[J].Brain Res Bull,2006,70(4-6):263-269.

[13]Greicius MD,Menon V.Default-mode activity during a passive sensory task:uncoupled from deactivation but impacting activation[J].JCogn Neurosci,2004,16(9):1484-1492.

[14]Schlee W,Leirer V,Kolassa IT,et al.Age-related changes in neural functional connectivity and its behavioral relevance[J].BMCNeurosci,2012,13:16.

[15]Lustig C,Snyder AZ,Bhakta M,et al.Functional deactivations:change with age and dementia of the Alzheimer type[J].Proc Natl Acad Sci USA,2003,100(24):14504-14509.

[16]Greicius MD,Srivastava G,Reiss AL,et al.Default-mode network activity distinguishes Alzheimer's disease from healthy aging:evidence from functional MRI[J].Proc Natl Acad Sci USA,2004,101(13):4637-4642.

[17]Bai F,Zhang Z,Yu H,et al.Default-mode network activity distinguishes amnestic type mild cognitive impairment from healthy aging:a combined structural and resting-state functional MRIstudy[J].Neurosci Lett,2008,438(1):111-115.

[18]Threlkeld ZD,Jicha GA,Smith CD,et al.Task deactivation reductions and atrophy within parietal default mode regions are overlapping but only weakly correlated in mild cognitive impairment[J].JAlzheimers Dis,2011,27(2):415-427.

[19]Jin M,Pelak VS,Cordes D.Aberrant default mode network in subjects with amnestic mild cognitive impairment using resting-state functional MRI[J].Magn Reson Imaging,2012,30(1):48-61.

[20]Sperling RA,Laviolette PS,O'Keefe K,et al.Amyloid deposition is associated with impaired default network function in older persons without dementia[J].Neuron,2009,63(2):178-188.

[21]Andrews-Hanna JR,Snyder AZ,Vincent JL,et al.Disruption of large-scale brain systems in advanced aging[J].Neuron,2007,56(5):924-935.

[22]Lee L,Harrison LM,Mechelli A.A report of the functional connectivity workshop,Dusseldorf 2002[J].Neuroimage,2003,19(2):457-465.

[23]Biswal B,Yetkin FZ,Haughton VM,et al.Functional connectivity in the motor cortex of resting human brain using echo planar MRI[J].Magn Reson Med,1995,34(4):537-541.

[24]Lowe MJ.A historical perspective on the evolution of resting-state functional connectivity with MRI[J].MAGMA,2010,23(5-6):279-288.

[25]Lowe MJ,Phillips MD,Lurito JT,et al.Multiple sclerosis:low-frequency temporal blood oxygen level-dependent fluctuations indicate reduced functional connectivity-initial results[J].Radiology,2002,224(1):184-192.

[26]De Luca M,Beckmann CF,De Stefano N,et al.fMRI resting state networks define distinct modes of long distance interectious in the human brain[J].Neuroimage,2006,29(4):1359-1367.

[27]Zhou Z,Wang X,Klahr NJ,et al.A conditional Granger causality model approach for group analysis in functional MRI[J].Magn Reson Imaging,2011,29(3):418-433.

[28]Raichle ME,MacLeod AM,Snyder AZ,et al.A default mode of brain function[J].Proc Natl Acad Sci USA,2001,98(2):676-682.

[29]Sperling RA,Laviolette PS,O'Keefe K,et al.Amyloid deposition is associated with impaired default network function in older persons without dementia[J].Neuron,2009,63(2):178-188.

[30]Buckner RL,Andrews-Hanna JR,Schacter DL.The brain's default network:anatomy,function,and relevance to disease[J].Ann NYAcad Sci,2008,1124:1-38.