趙雪紅，高艷，樊小力，唐一通

制動是臨床治療骨關(guān)節(jié)疾病的一種常用治療手段，然而制動在保護受損組織的同時，也會對周圍健康組織產(chǎn)生不利的影響。制動引起的最明顯變化是廢用性肌肉萎縮。正常的肌肉功能一方面依賴于骨骼肌自身結(jié)構(gòu)的完整，更重要的是依賴于正常的神經(jīng)支配。研究資料表明，在制動條件下神經(jīng)系統(tǒng)的改變在廢用性肌萎縮發(fā)生中有著極其重要的作用，但以往的研究都集中在中樞神經(jīng)的改變上[1-4]。迄今為止，很少有外周神經(jīng)傳導(dǎo)功能改變方面的研究，尤其是感覺神經(jīng)纖維的傳導(dǎo)功能。本研究擬采用電生理技術(shù)，觀察后肢制動條件下大鼠比目魚肌神經(jīng)纖維傳導(dǎo)功能的改變，旨在揭示廢用性肌萎縮發(fā)生的機制，為進(jìn)一步制定有效的防治肌萎縮的措施提供研究資料。

1 材料與方法

1.1 實驗動物分組

實驗選用24只健康雌性Sprague-Dawley大鼠，由西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院實驗動物中心提供，體質(zhì)量220～250 g。按體重配對原則隨機分為正常對照組、制動7 d組和制動14 d組，每組8只。所有實驗動物單籠喂養(yǎng)，能夠自由活動與進(jìn)食、進(jìn)水。室溫保持在20～25℃，人工控制動物室內(nèi)照明，每晝夜均保持12 h光明與黑暗交替循環(huán)。

1.2 后肢制動模型的建立

制動組大鼠采用改良后Bobath等的方法建立大鼠后肢制動模型[5-6]。動物用水合氯醛0.4 g/kg腹腔注射麻醉，在其左側(cè)后肢的踝關(guān)節(jié)、膝關(guān)節(jié)及腹股溝等血管容易受壓處襯一層薄厚適宜的棉墊，然后用石膏繃帶由踝關(guān)節(jié)向上纏繞至大腿與腹股溝處，將動物后肢固定在縮短位。在石膏層的外面用一層銅網(wǎng)保護，以防止動物咬毀石膏。

1.3 手術(shù)及固定

動物經(jīng)腹腔注射戊巴比妥鈉45 mg/kg麻醉，行常規(guī)氣管插管和頸靜脈插管術(shù)。將動物置于恒溫控制操作臺上，頭部固定于腦立體定位儀上，實驗開始后動物用箭毒制動行人工呼吸，頻率控制在75次/min，視動物呼吸幅度及狀態(tài)調(diào)節(jié)通氣量，整個實驗過程中用示波器連續(xù)監(jiān)測動物心電(R-R間期維持在120～160 ms)，用溫控儀將體溫維持在37～38℃，隨時觀察動物瞳孔大小及皮膚色澤。

1.3.1 椎板切開術(shù) 沿正中線縱行切開皮膚，向兩側(cè)分開豎脊肌，切除第2至第1骶椎脊突及椎板，撕去硬脊膜及珠網(wǎng)膜，暴露腰骶脊髓，并辨認(rèn)左側(cè)L4、L5、L6背根，做標(biāo)記備用。最后拉起皮瓣，縫制油槽，內(nèi)充37℃左右的液體石蠟加以保護。

1.3.2 比目魚肌及比目魚肌神經(jīng)分離術(shù) 分離大腿后側(cè)肌與腓腸肌，暴露比目魚肌，從比目魚肌逆行分離比目魚肌神經(jīng)至脛神經(jīng)處，暴露坐骨神經(jīng)主干及其主要分支。切斷比目魚肌神經(jīng)以外的分支。

1.4 神經(jīng)纖維動作電位傳導(dǎo)速度的測定

1.4.1 傳入神經(jīng)傳導(dǎo)速度 在背根細(xì)束上置一單極鉑金絲電極，作為記錄電極；在比目魚肌神經(jīng)上置一雙銀絲電極作為刺激電極。在記錄電極上引導(dǎo)比目魚肌肌梭單一細(xì)束傳入放電(CED 1401，英國CED公司)。測量該動作電位的潛伏期，作為該動作電位在刺激電極與記錄電極之間的傳導(dǎo)時間(t)。實驗結(jié)束后沿比目魚肌神經(jīng)逆行分離神經(jīng)纖維至記錄電極處的背根細(xì)束，用絲線測量該段神經(jīng)纖維的長度，作為該動作電位在刺激電極與記錄電極之間傳導(dǎo)的距離(s)。按照公式V=s/t計算該動作電位的傳導(dǎo)速度(V)。

1.4.2 M波潛伏期 在比目魚肌遠(yuǎn)側(cè)端的肌腱上用手術(shù)線結(jié)扎，離斷比目魚肌遠(yuǎn)側(cè)端肌腱。測量比目魚肌最小生理長度(約為22.43±3.12 mm)和最大體內(nèi)長度(約為28.45±4.17 mm)。最后制備下肢油槽，內(nèi)充37℃左右的液體石蠟加以保護。

將一對雙銀絲電極(電極間距為2 mm)作為刺激電極置于坐骨神經(jīng)上，陰極靠近中樞端。同心針電極作為記錄電極垂直于肌纖維方向刺入比目魚肌肌腹處。以2倍閾刺激強度的方波電流刺激坐骨神經(jīng)(SEN-7203，日本NIHON KONDEN公司)，引導(dǎo)比目魚肌M波。

1.5 統(tǒng)計學(xué)分析

采用SPSS 10.0統(tǒng)計軟件對實驗數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。實驗數(shù)據(jù)以表示，采用單因素方差(ANOVA)分析，顯著性水平α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 傳入神經(jīng)傳導(dǎo)速度

本研究用分離單一神經(jīng)細(xì)束的方法在24只大鼠脊髓背根的比目魚肌肌梭傳入神經(jīng)上共獲得99個單位，按照Hunt(1954)的分類標(biāo)準(zhǔn)[7]，屬于Ⅰ類傳入神經(jīng)纖維的單位(傳導(dǎo)速度大于72 m/s)共有59個，屬于Ⅱ類傳入神經(jīng)纖維的單位(傳導(dǎo)速度為24～72 m/s)共有40個。

制動7 d后，大鼠比目魚肌肌梭Ⅰ類傳入神經(jīng)纖維的傳導(dǎo)速度與正常對照組相比明顯減慢(P<0.01)；Ⅱ類傳入神經(jīng)纖維與正常對照組相比傳導(dǎo)速度也減慢，但無顯著性差異(P>0.05)。制動14 d后，Ⅱ類神經(jīng)末梢的傳導(dǎo)速度也降低(P<0.05)。見表1。

表1 制動對比目魚肌肌梭傳入神經(jīng)傳導(dǎo)速度的影響

2.2 M波潛伏期

制動7 d組M波潛伏期與正常對照組相比無顯著性差異(P>0.05)；制動14 d后，M波潛伏期延長(P<0.05)。見表2。

表2 制動對比目魚肌M波潛伏期的影響

3 討論

本研究利用電生理實驗技術(shù)，觀察后肢制動對大鼠比目魚肌神經(jīng)纖維傳導(dǎo)功能的影響。比目魚肌神經(jīng)是一種混合神經(jīng)，它包含比目魚肌的感覺傳入和支配比目魚肌運動的運動神經(jīng)元的軸突纖維。

M波潛伏期通常作為研究神經(jīng)肌肉傳遞功能的指標(biāo)，反映的是運動神經(jīng)纖維的傳導(dǎo)功能。它由三個部分組成：①從刺激點到有髓神經(jīng)末梢的傳導(dǎo)時間；②從無髓末梢經(jīng)運動終板到所支配肌纖維的傳遞時間，即神經(jīng)-肌肉接頭的傳遞時間；③產(chǎn)生肌纖維動作電位所需的時間，即在肌纖維上的傳播時間。無論哪一部分結(jié)構(gòu)功能的改變均會對M波潛伏期產(chǎn)生影響。Canu等研究表明，神經(jīng)纖維髓鞘的厚度呈活動依賴性，廢用條件下髓鞘的厚度降低[8]。Alves等最新研究也證實，制動條件下大直徑的神經(jīng)纖維髓鞘厚度降低[9]。研究資料表明，制動后神經(jīng)-肌肉接頭的結(jié)構(gòu)發(fā)生失神經(jīng)樣改變，與肌肉興奮-收縮耦聯(lián)相關(guān)的膜系統(tǒng)結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，肌纖維膜的電學(xué)特性也發(fā)生改變[10-12]，這些變化必然會影響神經(jīng)-肌肉接頭處動作電位的擴布。另外，由于制動后肌肉萎縮，肌纖維的直徑減小，這均會影響到動作電位在軸突末梢和肌纖維的傳導(dǎo)，導(dǎo)致M波潛伏期的延長。本研究結(jié)果表明，制動14 d后大鼠比目魚肌M波潛伏期延長。這與Cruz-Martínez等[13]和 Ruegg等[14]的研究結(jié)果一致。

本研究結(jié)果表明，后肢制動7 dⅠa類感覺末梢的傳導(dǎo)速度降低，明顯早于M波潛伏期的改變。Ⅰa纖維即肌梭的初級感覺末梢，是背根節(jié)(DRG)神經(jīng)元的外周突，進(jìn)入肌梭后主要感受所在骨骼肌的動態(tài)長度變化。神經(jīng)營養(yǎng)因子-3(neurotrophin-3,NT-3)是本體感覺神經(jīng)元存活和發(fā)揮生理功能所必需的營養(yǎng)因子[15-16]。在成年大鼠的骨骼肌組織中，NT-3主要在肌梭的梭內(nèi)肌纖維中表達(dá)，而且主要是在核袋纖維中表達(dá)[17]。本課題組以往研究表明，在脫負(fù)荷條件下，肌梭NT-3的表達(dá)減少[18]，NT-3的表達(dá)減少必然會引起本體感覺神經(jīng)功能的改變。Hirose等的研究還發(fā)現(xiàn)，后肢脫負(fù)荷3 d肌梭的Ⅰ型膠原蛋白的表達(dá)降低[19]。因此我們推測Ⅰa類傳入纖維傳導(dǎo)功能的改變主要與肌梭的改變有關(guān)。

在制動條件下骨骼肌處于脫負(fù)荷狀態(tài)，肌梭的生理性牽拉刺激減少，因此肌梭的傳入放電活動必然受到影響。我們前期的研究也證實，后肢制動3 d后，肌梭的自發(fā)性傳入放電活動即明顯抑制，幾乎所有肌梭在靜息長度下無自發(fā)放電，而且感覺末梢動作電位時程隨制動時間的延長而延長(待發(fā)表)。動作電位時程的延長必將影響神經(jīng)纖維上動作電位的傳導(dǎo)。神經(jīng)纖維傳導(dǎo)速度的降低，反過來將進(jìn)一步影響肌梭向中樞的信息傳遞。

綜上所述，在制動條件下神經(jīng)傳導(dǎo)功能降低，而且傳入神經(jīng)纖維的功能改變要早于且重于運動神經(jīng)纖維。因此，我們推測，在制動期間增加肌梭的傳入活動能更有效延緩和/或?qū)怪苿訔l件下神經(jīng)肌肉功能的改變。

[1]Gondin J,Guette M,Maffiuletti NA,et al.Neural activation of the triceps surae is impaired following 2 weeks of immobilization[J].Eur JAppl Physiol,2004,93(3):359-365.

[2]Lundbye-Jensen J,Nielsen JB.Central nervous adaptations following 1 wk of wrist and hand immobilization[J].J Appl Physiol(1985),2008,105(1):139-151.

[3]Seki K,Kizuka T,Yamada H.Reduction in maximal firing rate of motoneurons after 1-week immobilization of finger muscle in human subjects[J].J Electromyogr Kinesiol,2007,17(2):113-120.

[4]Kühn S,Werner A,Lindenberger U,et al.Acute immobilisation facilitates premotor preparatory activity for the non-restrained hand when facing grasp affordances[J].Neuroimage,2014,92C:69-73.

[5]Booth FW,Kelso JR.Production of rat muscle atrophy by cast fixation[J].JAppl Physiol,1973,34(3):404-406.

[6]趙雪紅,樊小力,宋新艾,等.100 Hz正弦波振動對制動大鼠比目魚肌M波和H反射的影響[J].浙江大學(xué)學(xué)報醫(yī)學(xué)版,2011,40(5):545-549.

[7]Hunt CC.Relation of the function to diameter in afferent fibers of muscle nerves[J].JGen Physiol,1954,38(1):117-131.

[8]Canu MH,Carnaud M,Picquet F,et al.Activity-dependent regulation of myelin maintenance in the adult rat[J].Brain Res,2009,1252:45-51.

[9]Alves JS,Leal-Cardoso JH,Santos-Junio FFU,et al.Limb immobilization alters functional electrophysiological parameters of sciatic nerve[J].Braz JMed Biol Res,2013,46(8):715-721.

[10]Fahim MA.Rapid neuromuscular remolding following limb immobilization[J].Anat Rec,1989,224(1):102-109.

[11]Lee S,Yang HS,Sasakawa T,et al.Immobilization with atrophy induces de novo expression of neuronal nicotinicα7 acetylcholine receptors in muscle contributing to neurotransmission[J].Anesthesiology,2014,120(1):76-85.

[12]Kravtsova VV,Shenkman BS,Mikha?lov VM,et al.Effect of functional unloading and dystrophin deficit on the local hyperpolarization of the postsynaptic membrane of a skeletal muscle fiber[J].Biofizika,2010,55(5):834-841.

[13]Cruz-Martínez A,Arpa J.Muscle fiber conduction velocity in situ(MFCV)in denervation,reinnervation and disuse atrophy[J].Acta Neurol Scand,1999,100(5):337-340.

[14]Ruegg DG,Kakebeeke TH,Gabriel JP,et al.Conduction velocity of nerve and muscle fiber action potentials after a space mission or a bed rest[J].Clinical Neurophysiology,2003,114(1):86-93.

[15]Liu J,Chen SS,Dan QQ,et al.Crucial roles of NGF in dorsal horn plasticity in partially deafferentated cats[J].Growth Factors,2011,29(2-3):49-56.

[16]Ramer MS.Endogenous neurotrophins and plasticity following spinal deafferentation[J].Exp Neurol,2012,235(1):70-77.

[17]Copray JC,Brouwer N.Selective expression of neurotrophin-3 messenger RNA in musclespindles of therat[J].Neuroscience,1994,63(4):1125-1135.

[18]任俊嬋,樊小力,宋新艾,等.模擬失重條件下大鼠比目魚肌肌梭神經(jīng)營養(yǎng)因子3表達(dá)降低[J].生理學(xué)報,2011,63(1):75-80.

[19]Hirose T,Nakazato K,Song H,et al.TGF-beta1 and TNF-alpha are involved in the transcription of type I collagen alpha2 gene in soleus muscle atrophied by mechanical unloading[J].J Appl Physiol,2008,104(1):170-177.