趙硯棠，于宏曉，陳建軍，張東海，岳勇，許鍇霖，李洪濤，鄭軒，周仕祿，徐海濤

山東中煙工業(yè)有限責(zé)任公司技術(shù)中心 濟(jì)南市將軍路171號(hào) 250100

主流煙氣氨釋放量與煙葉中蛋白質(zhì)和氨基酸含量相關(guān)性研究

趙硯棠，于宏曉，陳建軍，張東海，岳勇，許鍇霖，李洪濤，鄭軒，周仕祿，徐海濤

山東中煙工業(yè)有限責(zé)任公司技術(shù)中心 濟(jì)南市將軍路171號(hào) 250100

運(yùn)用方差分析法研究了不同產(chǎn)區(qū)、不同部位煙葉中蛋白質(zhì)、氨基酸含量和主流煙氣中氨釋放量的差異。采用描述統(tǒng)計(jì)、逐步回歸分析、偏相關(guān)分析和通徑分析研究了煙葉中蛋白質(zhì)、氨基酸含量與主流煙氣中氨釋放量的關(guān)系,建立了多元逐步回歸方程。結(jié)果表明：煙葉中蛋白質(zhì)、脯氨酸與主流煙氣中氨呈極顯著相關(guān)；煙葉中蛋白質(zhì)、脯氨酸與主流煙氣中氨釋放量的相關(guān)性主要取決于直接作用。

氨；蛋白質(zhì)；氨基酸；逐步回歸分析；通徑分析

對(duì)卷煙的吸味質(zhì)量和勁頭具有重要作用[2-4]。同時(shí)氨可在燃燒時(shí)與糖等發(fā)生反應(yīng),形成香味物質(zhì)[5-6]。煙氣中過高的氨釋放量不僅使煙氣粗糙,影響卷煙的吃味,而且會(huì)刺激人體的呼吸系統(tǒng),長(zhǎng)期吸入會(huì)對(duì)人體造成較嚴(yán)重的危害。卷煙主流煙氣中的氨是“Hoffmann List”44種有害成分之一,國(guó)內(nèi)煙草行業(yè)已經(jīng)將氨納入卷煙安全性質(zhì)量評(píng)價(jià)指標(biāo)。煙草中含氮化合物數(shù)量眾多且復(fù)雜,都可能是卷煙煙氣中氨的前體物,國(guó)內(nèi)外關(guān)于卷煙煙氣中氨的形成機(jī)理研究報(bào)道相對(duì)較少且存在爭(zhēng)論。前期我們研究了主流煙氣中氨釋放量與煙草中無機(jī)氮包括硝酸鹽、銨鹽和亞硝酸鹽含量的相關(guān)性,發(fā)現(xiàn)主流煙氣中氨釋放量高低與煙葉中無機(jī)含氮成分亞硝酸根含量正相關(guān)性更強(qiáng)。蛋白質(zhì)和氨基酸是煙草中重要的兩類有機(jī)含氮成分,Johnson[7]認(rèn)為煙氣中的氨來源于硝酸鹽還原和甘氨酸熱裂解。而Yves[8]則認(rèn)為煙氣中的氨來源于煙草中的銨鹽。Hansson[9-10]和Sharma[11-12]分別報(bào)道了蛋白質(zhì)和某些氨基酸在熱裂解條件下能夠生成氨。降低主流煙氣中氨釋放量和探索主流煙氣中氨的產(chǎn)生機(jī)理是國(guó)內(nèi)外煙草行業(yè)急需解決的問題。

本文采用逐步回歸分析、偏相關(guān)分析和通徑分析等統(tǒng)計(jì)方法,對(duì)主流煙氣中氨釋放量和煙葉中蛋白質(zhì)、氨基酸含量的關(guān)系進(jìn)行綜合分析,旨在進(jìn)一步探索其相關(guān)性,為研究主流煙氣氨的產(chǎn)生機(jī)理提供參考。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

SM450型20通道吸煙機(jī)（英國(guó)Cerulean公司）,AAⅢ連續(xù)流動(dòng)分析儀（德國(guó)布朗盧比公司）,氨基酸分析儀（德國(guó)賽卡姆公司）,電子天平（瑞士梅特勒公司）,ZP-200振蕩器（中國(guó)江蘇太倉(cāng)實(shí)驗(yàn)設(shè)備廠）,Millipore超純水系統(tǒng)（美國(guó)Millipore公司）。

甲基磺酸、冰醋酸、濃硫酸、次氯酸鈉、氫氧化鈉和硫酸銨（分析純,國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）,茚三酮（＞99%,德國(guó)Merck公司）,聚氧乙烯月桂醚（德國(guó)Sigma公司）,18種氨基酸標(biāo)樣（＞99%,德國(guó)Sigma公司）,37%鹽酸（德國(guó)Merck公司）,其他試劑均為優(yōu)級(jí)純,實(shí)驗(yàn)用水均為電阻率18.2MΩ·cm的超純水。

1.2 分析方法

依據(jù)YC/T377-2010 卷煙主流煙氣中氨的測(cè)定離子色譜法,測(cè)定主流煙氣中氨的含量；依據(jù)YC/T31-1996制備煙末樣品和水分測(cè)定,參考YC/T249-2008煙草及煙草制品蛋白質(zhì)的測(cè)定連續(xù)流動(dòng)法,測(cè)定煙草中的蛋白質(zhì)含量；依據(jù)YC/T 282-2009 煙葉中游離氨基酸的測(cè)定氨基酸分析儀法,測(cè)定煙草中游離氨基酸的含量。

1.3 煙支樣品的選擇

將山東、云南、福建三個(gè)產(chǎn)區(qū)不同年份（2007、2008）、不同部位（上部、中部和下部）18個(gè)烤煙煙葉樣品卷成煙支,選取平均重量0.90±0.01 g、平均吸阻1000±50 Pa 范圍內(nèi)的煙支為合格煙支。卷煙圓周為24.5 mm,長(zhǎng)度為84 mm,濾嘴長(zhǎng)度25 mm,實(shí)驗(yàn)前在溫度（22±1）℃、相對(duì)濕度（60±2）%條件下平衡。

2 結(jié)果和討論

2.1 不同產(chǎn)區(qū)、不同部位煙葉中蛋白質(zhì)、氨基酸的含量和主流煙氣中氨釋放量

由表1和表2可見,蛋白質(zhì)的含量和煙氣中的氨釋放量隨部位的變化趨勢(shì)一致,都是上部葉中分別高于中部葉和下煙葉。而煙葉中18種游離氨基酸的含量,其變化規(guī)律隨著煙葉部位的不同變化不明顯。初步推斷煙葉主流煙氣中氨釋放量與煙葉中蛋白質(zhì)的含量相關(guān)。

表1 山東、云南、福建不同部位煙葉中蛋白質(zhì)含量及主流煙氣中氨釋放量Tab.1 The release of ammonia in mainstream smoke and the contents of protein and in different parts of tobacco leaves from Shandong, Yunnan, and Fujian

2.2 不同產(chǎn)區(qū)、不同部位煙葉中蛋白質(zhì)、氨基酸的含量和主流煙氣中氨釋放量描述統(tǒng)計(jì)

由表3可知,煙葉中賴氨酸的變異系數(shù)最大,煙葉中蛋白質(zhì)的變異系數(shù)最小。由峰度系數(shù)可以看出,天冬氨酸、異亮氨酸、蛋白質(zhì)、胱氨酸、絲氨酸和主流煙氣中氨的峰度系數(shù)均小于0,為扁平分布,說明數(shù)據(jù)的分布比較分散；其余各項(xiàng)指標(biāo)的峰度系數(shù)均大于0,為尖峰分布,說明數(shù)據(jù)的分布更集中。由偏度系數(shù)可以看出,煙葉中精氨酸、谷氨酸、色氨酸、絲氨酸、苯丙氨酸、胱氨酸、脯氨酸、異亮氨酸和主流煙氣中氨的偏度系數(shù)均小于0,為負(fù)態(tài)偏向峰；其余各項(xiàng)指標(biāo)的偏度系數(shù)均大于0,為正態(tài)偏向峰。

表2 山東、云南、福建不同部位煙葉中氨基酸含量及主流煙氣中氨釋放量Tab.2 The ammonia in mainstream smoke and the contents offree amino acidsin different parts of tobacco leaves from Shandong, Yunnan, and Fujian

表3 煙葉中蛋白質(zhì)、氨基酸和主流煙氣中氨釋放量描述統(tǒng)計(jì)Tab.3 Descriptive statistic analysis on the contents of protein, free amino acids in tobacco leaves and the ammonia contents in mainstream smoke

2.3 不同產(chǎn)區(qū)、不同部位的煙葉中蛋白質(zhì)、氨基酸的含量和主流煙氣中氨釋放量的變異分析

由表4可以看出,部位對(duì)主流煙氣中氨釋放量影響達(dá)到了極顯著水平（p＜0.01）,部位對(duì)煙葉中蛋白質(zhì)含量的影響達(dá)到了顯著水平（p＜0.05）。地區(qū)因素對(duì)煙葉中甘氨酸、苯丙氨酸和組氨酸含量的影響達(dá)到了顯著水平（p＜0.05）,部位和地區(qū)因素均對(duì)煙葉中丙氨酸、脯氨酸含量的影響達(dá)到了顯著水平（p＜0.05）。

多元逐步回歸分析是一種應(yīng)用廣泛、側(cè)重于考察多個(gè)自變量與一個(gè)依變量關(guān)系的數(shù)量分析方法,所建立的“最優(yōu)”回歸模型,剔除了對(duì)依變量無顯著影響的自變量,僅保留對(duì)依變量有顯著影響的自變量,篩選出影響依變量的主要自變量。其做法是將逐個(gè)引入自變量,引入的條件是該自變量經(jīng)F檢驗(yàn)是顯著的,每引入一個(gè)自變量后,對(duì)已選入的變量進(jìn)行逐個(gè)檢驗(yàn),如果原來引入的變量由于后面變量的引入而變得不再顯著,那么就將其剔除。引入一個(gè)變量或從回歸方程中剔除一個(gè)變量,為逐步回歸的一步,每一步都要進(jìn)行F檢驗(yàn),以確保每次引入新變量之前回歸方程中只包含顯著的變量。這個(gè)過程反復(fù)進(jìn)行,直到既沒有不顯著的自變量選入回歸方程,也沒有顯著自變量從回歸方程中剔除為止。

表4 方差分析結(jié)果Tab.4 Variance analysis of the contents of protein, free amino acids in tobacco leaves and the ammonia contents in mainstream smoke

2.4 不同產(chǎn)區(qū)、不同部位煙葉中蛋白質(zhì)、氨基酸的含量和主流煙氣中氨釋放量的逐步回歸分析

以主流煙氣中氨釋放量為因變量(Y),以煙葉中蛋白質(zhì)(X1)、天冬氨酸(X2)、蘇氨酸(X3)、絲氨酸(X4)、谷氨酸(X5)、甘氨酸(X6)、丙氨酸(X7)、纈氨酸(X8)、胱氨酸(X9)、蛋氨酸(X10)、異亮氨酸(X11)、亮氨酸(X12)、酪氨酸(X13)、苯丙氨酸(X14)、組氨酸(X15)、色氨酸(X16)、賴氨酸(X17)、精氨酸(X18)、脯氨酸(X19)為自變量,通過煙葉中蛋白質(zhì)、氨基酸與主流煙氣中氨釋放量進(jìn)行逐步回歸分析,得到最優(yōu)多元線性回歸方程：Y=-6.957+2.064 X1+0.547 X19,相關(guān)系數(shù)為0.799?；貧w方程的方差分析結(jié)果（表5）表明,回歸方程是極顯著的。殘差診斷的Durbin-waston統(tǒng)計(jì)量DW=1.637,接近于2,表示殘差分布較好且無明顯共線性存在,自相關(guān)性較小。篩選留下的煙葉中蛋白質(zhì)、氨基酸對(duì)主流煙氣中氨的決定系數(shù)R2=0.639,表明應(yīng)用以上模型能解釋63.9%的因變量變化,回歸方程具有較好的參考價(jià)值。

表5 回歸方程的方差分析Tab.5 Variance analysis of regression equation

2.5 偏相關(guān)分析

研究多個(gè)變量之間的相關(guān)關(guān)系時(shí),由于變量間常常是相互影響的,因而僅僅研究?jī)蓚€(gè)變量間的簡(jiǎn)單相關(guān)系數(shù)往往不能正確反映兩個(gè)變量間的真正關(guān)系,有時(shí)甚至是假象,只有排除其他變量影響的情況下,計(jì)算它們之間的偏相關(guān)系數(shù)才能真實(shí)揭示它們之間的內(nèi)在聯(lián)系。

通過對(duì)逐步回歸分析中篩選留下的煙葉中蛋白質(zhì)(X1)、脯氨酸(X19)與主流煙氣中氨釋放量(Y)進(jìn)行偏相關(guān)分析,結(jié)果見表6。由表6可知,X1和X19呈極顯著正相關(guān),說明煙葉中蛋白質(zhì)、脯氨酸的增加都有利于主流煙氣中氨釋放量升高。以建模數(shù)據(jù)以外的8個(gè)樣本數(shù)據(jù)代入模型,由表7可知,預(yù)測(cè)值與實(shí)際值的相對(duì)偏差總體較小,表明模型具有一定的可靠性。

表6 偏相關(guān)分析Tab.6 Partial correlation analysis between the contents of protein, free amino acids in tobacco leaves and the ammonia contents in mainstream smoke

表7 葉中蛋白質(zhì)、脯氨酸與主流煙氣中氨釋放量模型驗(yàn)證結(jié)果Tab.7 The verification results of model between the contents of protein, free amino acids in tobacco leaves and the ammonia contents in mainstream smoke

2.6 通徑分析

通徑分析就是應(yīng)用通徑系數(shù)分析方法,在相關(guān)分析與回歸分析的基礎(chǔ)之上,進(jìn)一步研究因變量與自變量之間的數(shù)量關(guān)系,并可將相關(guān)系數(shù)分解為直接作用系數(shù)和間接作用系數(shù),以揭示各個(gè)因素對(duì)因變量的相對(duì)重要性。

相關(guān)性分析結(jié)果反映了各化學(xué)成分在其他因素的協(xié)同作用下對(duì)主流煙氣中氨釋放量的綜合效果,僅反映兩性狀間的表型相關(guān),不能真正反映各化學(xué)成分對(duì)主流煙氣中氨釋放量的直接或本質(zhì)的作用。因此,有必要在此基礎(chǔ)上再進(jìn)行通徑分析,對(duì)相關(guān)系數(shù)進(jìn)行剖分,估算出蛋白質(zhì)和脯氨酸對(duì)主流煙氣中氨釋放量的直接效應(yīng)和間接效應(yīng),進(jìn)一步揭示蛋白質(zhì)和脯氨酸對(duì)主流煙氣中氨的含量的作用,通過通徑分析（表8）可知,煙葉中蛋白質(zhì)、脯氨酸對(duì)主流煙氣中氨為正直接作用,蛋白質(zhì)對(duì)主流煙氣中氨釋放量的直接作用大于脯氨酸對(duì)主流煙氣中氨釋放的直接作用。

從間接作用看,篩選留下的煙葉中蛋白質(zhì)(X1)、脯氨酸(X19)對(duì)主流煙氣中氨為正間接作用,但是遠(yuǎn)遠(yuǎn)小于兩者對(duì)主流煙氣中氨的直接作用。因此煙葉中蛋白質(zhì)、脯氨酸對(duì)主流煙氣中氨的影響主要取決于直接作用。

表8 通徑分析Tab.8 Path analysis between the contents of protein, free amino acids in tobacco leaves and the ammonia contents in mainstream smoke

3 結(jié)論

綜合相關(guān)分析、通徑分析結(jié)果,蛋白質(zhì)和脯氨酸是影響主流煙氣中的氨釋放量的2個(gè)主要化學(xué)成分。通過對(duì)煙葉中蛋白質(zhì)、氨基酸與主流煙氣中氨釋放量進(jìn)行逐步回歸分析建立多元回歸模型,回歸方程及回歸系數(shù)都達(dá)到了顯著水平,表明篩選出的蛋白質(zhì)、脯氨酸2個(gè)煙葉化學(xué)成分與煙氣中氨的釋放量之間存在著真實(shí)的多元回歸關(guān)系。通徑分析表明,蛋白質(zhì)、脯氨酸與主流煙氣中氨釋放量的相關(guān)主要由其直接作用形成的,間接作用影響不大。主流煙氣中的氨釋放量與其煙葉中的蛋白質(zhì)和脯氨酸含量呈極顯著正相關(guān),降低煙葉中蛋白質(zhì)和脯氨酸含量,有利于降低其主流煙氣中氨釋放量。

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Relationships between ammonia content in mainstream cigarette smoke and contents of protein and free amino acid in tobacco leaves

ZHAO Yantang, YU Hongxiao, CHEN Jianjun, ZHANG Donghai, YUE Yong, XU Kailin, LI Hongtao, ZHENG Xuan, ZHOU Shilu, XU Haitao
Technology Center, China Tobacco Shandong Industrial Co.Ltd., Jinan 250100, China

Relation between contents of protein, free amino acids in tobacco leaves and ammonia contents in mainstream cigarette smoke was investigated by analysis of variance, descriptive statistics, stepwise regression, partial correlation and path analysis.Multiple stepwise regression equation was established.Results showed that ammonia contents in mainstream cigarette smoke were significantly positively correlated with contents of protein and proline in tobacco leaves.

ammonia, protein, amino acids, stepwise regression analysis, path analysis

10.3969/j.issn.1004-5708.2014.03.004

TS411 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號(hào)：1004-5708（2014）03-0023-07

趙硯棠（1964—）,本科,工程師,主要從事煙草科技,Email: zhyt706@126.com

于宏曉,博士,山東中煙工業(yè)有限責(zé)任公司技術(shù)中心,主要從事煙草化學(xué)分析,Tel：0531-88776553,Email：rodyu@163.com

2013-05-23