王冬，張小全，楊鐵釗，薛剛，李麗華

河南農業(yè)大學煙草學院,鄭州市文化路95號,450002

綜述

類西柏烷二萜代謝機理及調控研究進展

王冬，張小全，楊鐵釗，薛剛，李麗華

河南農業(yè)大學煙草學院,鄭州市文化路95號,450002

綜述了類西柏烷二萜合成的生化途徑及其調控因素,并闡述了其在改善作物香味和植物抗蟲方面的作用及研究利用前景。類西柏烷二萜主要存在于煙草屬植物的腺毛分泌物中,在西柏三烯醇合酶（CBTS）和細胞色素P450加氧酶（CYP450）的催化下經脫氧木酮糖磷酸代謝途徑（DXP）合成,這一過程受到基因和多種外界因素的調控。

類西柏烷二萜；西柏三烯醇合酶；細胞色素P450加氧酶；香味風格；抗蟲性

類西柏烷二萜（Cembranoid diterpenes）較多地存在于煙草屬植物葉片和花的表面分泌物中,主要包括西柏三烯醇（Cembratrien-ol, CBT-ol）和西柏三烯二醇（Cembratrien-diol, CBT-diol）[1],由香葉基香葉基焦磷酸（Geranylgeranyl diphosphate,GGPP）在植物質體代謝途徑中的西柏三烯醇合酶（Cembratrienol synthase,CBTS）[2]和 細 胞 色 素 P450加 氧 酶（Cytochrome P450 hydroxylase, CYP450）[3]的催化作用下合成。這兩種醇分別具有2種同分異構體：（1S,2E,4R,7E,11E）-和（1S,2E,4S,7E,11E）-西柏-2,7,11-三烯-4（,6）-（二）醇,即α-和β-西柏三烯（二）醇[4]。通常CBT-diol比CBT-ol含量更多而且分布更加廣泛,在栽培利用的煙草品種中,前者的含量至少比后者高出100倍,是西柏烷二萜最主要的成分[5]。CBT-diol的2種的同分異構體含量比例接近3:1,在煙葉的生長和調制過程中,可降解成多種物質,包括茄酮、氧化茄酮、酮酸和分支的脂肪族酸[6]。類西柏烷二萜及其降解衍生物不僅與人體感官關系密切（如煙草香味和吸食質量以及一些植物表面清香氣味等）[1,7],而且與昆蟲和微生物具有互動性能,具有很好的殺蟲和殺菌活性[3,8-10]。

1 類西柏烷二萜的生物合成

1.1 類西柏烷二帖的生物合成途徑

類西柏烷二萜通常是由植物體內的GGPP經過CBTS和CYP450的催化作用在脫氧木酮糖磷酸代謝途徑（1-Deoxy-D-Xylulose-5-Phosphate Pathway, DXP）中形成的,GGPP是植物萜類代謝DXP途徑的一種中間產物,由異戊烯焦磷酸（Isopentenyl diphosphate, IPP）和二甲基烯丙基焦磷酸(Dimethylallyl diphosphate, DMAPP)合成,而其最初的供體是植物糖酵解過程中產生的丙酮酸（Pyruvic acid）和3-磷酸甘油醛（3-phosphoglyceraldehyde）[11]。

在煙草中,西柏烷二萜的合成反應大致分為兩步：第一步,GGPP為CBT-ol的形成提供了西柏烷骨架結構,在CBTS的作用下,GGPP發(fā)生環(huán)化反應,形成α-和β-CBT-ol[5]；第二步,經過CYP450作用,CBT-ol的第6位碳發(fā)生羥化反應形成α-和β-CBT-diol[3]。除CBT-ol之外,還有至少兩種雙萜物質由GGPP發(fā)生環(huán)化作用而形成,分別是順-冷杉醇（cisabienol）和類賴百當二醇（Labdenediol）,對它們的形成起催化作用的酶分別是順-冷杉醇環(huán)化酶（cisabienol cyclase）[12]和賴百當二萜環(huán)化酶（Labdenediol cyclase）[13]。而且,有研究表明這一系列反應只發(fā)生在腺毛的腺體中[14-16]。

圖1 煙草類西柏烷二萜合成途徑[2,3,5,17-18]Fig.1 Biosynthetic pathway of cembranoid diterpenes

1.2 類西柏烷二萜合成途徑中兩個主要酶

1.2.1 CBTS

CBTS即西柏三烯醇合酶或西柏三烯醇環(huán)化酶,是一種可溶的單分子構造的酶,分子質量為58 kD,主要存在于煙草屬植物葉片腺毛中,能夠催化GGPP直接發(fā)生環(huán)化反應而形成類西柏烷單醇[5,19-20]。目前得到確認的3類雙萜環(huán)化酶有西柏三烯醇合酶（環(huán)化酶）（CBTS）、順-冷杉醇環(huán)化酶（Cisabienol Cyclase）和類賴百當二萜環(huán)化酶（Labdenediol Cyclase）,它們具有共同的反應底物,分別負責將GGPP轉化合成西柏三烯醇、順-冷杉醇和賴百當烯二醇（圖1）,有研究表明,這些酶之間存在競爭關系,因為當CBTS活性受到抑制時,會導致CBT-ol和CBT-diol的減少,而與之使用共同底物的順-冷杉醇和賴百當烯二醇的含量得到了升高[2]。這些環(huán)化酶催化形成的代謝產物在生物體內發(fā)揮多種生理功能,包括生長調節(jié)、抗病、抗蟲和改善作物風味品質等方面[10,21-23]。

Wang 和Wagner等[2]對CBTS的候選cDNA序列進行了鑒定,并進行了基因沉默處理后的轉基因,在轉基因植株中發(fā)現一些CBT-ol和CBT-diol含量極低的個體腺毛中都具有CYC-1基因缺失的mRNA片段,說明這個基因（CYC-1,Genebank Accession No.AY049090）的確編碼了CBTS。

1.2.2 CYP450

細胞色素P450羥化酶是一類在溫和條件下能夠把底物中反應惰性的碳氫鍵氧化的單加氧酶,廣泛地存在于動物、微生物和植物體內[24-25]。在真核生物中,CYP450作為一種膜結合蛋白,主要分布在內質網、微粒體和線粒體內膜上[26]。CYP450被譽為高等植物中最大的酶蛋白家族[27],家族成員催化的反應廣泛而復雜,主要有烷基的羥化,烯基的環(huán)氧化,烴基的氧化,氮、硫、氧位的脫烷基化,氮位的羥化和氧化,硫位的氧化,氧化性脫氨、脫鹵和脫氫,氧化性的碳碳鍵斷裂及一些還原反應等[28]。在煙草中,對于CYP450及其相關基因的研究大多數與抗蟲性有關。Mao等[29]構建CYP450基因CYP6AE14的RNAi載體轉化煙草,轉基因煙草葉片喂食棉鈴蟲幼蟲后發(fā)現CYP6AE14轉錄水平明顯下降,并且幼蟲對棉酚的敏感性增強,棉鈴蟲的生長明顯被抑制,從而提高了害蟲防治效果；張保龍等[30]采用同樣的方法,選取Q型煙粉虱體內的一個CYP450基因CYP6CM1的特異序列,構建RNAi載體并轉化煙草,喂食煙粉虱后實現了抗蟲效果。

煙草中負責催化CBT-ol發(fā)生羥化反應形成CBT-diol的羥化酶來自CYP450酶蛋白家族,有研究表明[3,18],這個酶僅存在于作物腺毛中,其編碼基因為CYP71D16（GenBank Accession No.AF166332）,對該基因進行抑制會導致CBT-diol的減少和CBT-ol含量的增加。

1.3 類西柏烷二萜生化途徑的調控

1.3.1 CBTS和CYP450基因的調控作用

CBTS以GGPP為底物催化合成西柏三烯醇,直接決定著植物腺毛分泌物中CBT-ol和CBT-diol的含量。除CBTS外,在植物中以GGPP為底物發(fā)生環(huán)化作用形成的二萜還有順-冷杉醇和賴百當二萜,但GGPP環(huán)化作用的具體走向以及所占比例如何,一方面由底物GGPP的豐富程度決定,另一方面則取決于CBTS以及相關酶的基因調控作用。在煙草中,CYC-1基因與CBT-ol的積累密切相關,CYC-1的沉默表達大大減少了CBT-ol的積累,進而影響CBT-diol的形成[2]；在對真菌中的CYC-1基因進行研究時發(fā)現該基因表達情況受2價鎂離子的調控[31]。CBT-ol雖然具有豐富的生物活性,但相對含量較低,絕大多數CBT-ol經CYP450催化形成了類西柏烷二萜的主要成分：CBT-diol。作為編碼CYP450的基因,CYP71D16在類西柏烷二萜合成中發(fā)揮著更加重要的作用。在對煙草中的CYP71D16進行沉默處理后發(fā)現,CBT-diol含量驟減,同時CBT-ol獲得了大量積累,而且植株的抗蟲性得到了提高[3]。因此,利用包括植物類西柏烷二萜在內的萜類代謝工程通過分子牧場制造有益的自然產物,具有極高的經濟價值和研究前景。

1.3.2 外界環(huán)境因素的調控作用

許多外界因素如施肥、水分、機械損傷、光照、土壤和溫度等對類西柏烷二萜的出現、表面沉積和穩(wěn)定性都有可能造成影響[1]。有研究表明,施氮量對腺毛分泌物的含量有顯著影響,增施氮肥,植物腺毛分泌物中CBT-diol含量將會減少[32-33]；時向東等研究表明,餅肥、腐殖酸與化肥配施能增加煙草葉面腺毛密度[34],但是關于作物葉片腺毛密度與其分泌物含量的關系,研究意見不一,陳淑珍等[35]認為腺毛數量與整葉分泌物量正相關,而Nielsen等[36]的研究結果表明在煙草中一些腺毛密度很小的品系,其腺毛分泌物的含量與腺毛密度呈正相關,而腺毛密度大的品系,其腺毛分泌物的含量與腺毛密度無關。適度的水分脅迫能提高煙葉表面CBT-diol和蔗糖酯等腺毛分泌物的含量,強降雨會顯著降低煙葉表面化合物的含量[1,37]。關于外部刺激,似乎沒有任何證據證明,當煙草屬植株受到昆蟲或者病原體的攻擊時,葉片中包括類西柏烷二萜物質在內的抗毒素會發(fā)生誘發(fā)分泌,這可能是由于當因外部脅迫誘發(fā)而大量產生植物抗毒素時,葉面分泌物作為第一道防線已經存在于成熟的葉片中[1,21]。有研究表明,縮短日照時數不利于蠟質成分的形成,但是可提高葉片中萜烯類物質的產生[38]；而遮蔭條件下,煙草CBT-diol的含量明顯低于正常光照條件[39-40]。Severson等[1]研究認為,低溫不利于類西柏烷二萜的合成,高溫環(huán)境能促進腺毛生長和腺毛分泌物的合成與轉化。

有研究表明,CBTS在pH低于6.8時,活性急劇降低,pH6.8-7.5是其活性適宜范圍[5],與類賴百當環(huán)化酶和順冷杉醇環(huán)化酶[13]一樣,2價陽離子是其活性發(fā)揮的必要條件[20]。CYP450同樣受多種因素調控而且是極易失活的。目前,已獲得CYP71D16的啟動子,可以此調控植株類西柏烷二萜的合成途徑,提高植株的抗病能力和香味品質[41]。不同的外界因素均可調控植物特定CYP450的表達,植物CYP450基因的表達表現出生長發(fā)育控制,一般認為其表達與其功能的需要相一致[26]；與此同時,植物CYP450基因的表達還受到光、脅迫[42-45]以及外來物質的誘導[45-47]。

2 類西柏烷二萜的生物降解

目前國內外關于煙葉中CBT-diol的生物降解途徑的研究比較少,而得到眾多學者公認的降解產物主要成分是茄酮（Solanone）[48]。茄酮的化學名稱為8-甲基-5-異丙基-6,8-壬二烯-2-酮,它是1965年美國煙草化學家Johnson和Nicholson從調制后的煙葉中發(fā)現的[49]。Demole和Dietrich在1977年對CBT-diol的生物降解進行了闡述（圖2）[50],在酶解或加熱等條件下,CBT-diol降解,在鍵的斷裂過程中,可產生多種降解產物,其中C13的產物為茄酮。Arnarp等[51]對CBT-diol的生物轉化進行了研究,發(fā)現在細胞培養(yǎng)的過程中,CBT-diol的第11位和12位碳之間的雙鍵受到酶的催化,可形成一種不穩(wěn)定的環(huán)氧化合物。結合Demole等人的研究結果不難發(fā)現,此處的環(huán)氧鍵位置即CBT-diol產生茄酮的斷鍵位置。

關于茄酮的去向,大致可分為3個方面：在單線態(tài)氧化作用下,茄酮發(fā)生分子重排反應,形成一種具有香味的環(huán)狀化合物——茄尼呋喃（圖2路線A）；與此同時,在酸的催化下,茄酮烯鍵與水作用形成醇,然后在過氧酸的作用下,形成不穩(wěn)定的環(huán)氧化合物,在酸的催化下這種環(huán)氧化合物的酮基和環(huán)氧基發(fā)生反應,進一步氧化形成一種具有特殊香味的雜氧雙環(huán)化合物（圖2路線B）；除了烯鍵,茄酮的羰基位置也較易發(fā)生反應,在過氧酸氧化后,再進行堿性還原可得到一種C11的醇,該醇再經氧化作用,可形成含羥基的C10不飽和酮,這種酮在酸性介質中可環(huán)化成為四氫吡喃的羰基衍生物,經進一步氧化,可得到重要的香味物質α-異丙基丁內酯（圖2路線C）。

圖2 煙草類西柏烷二萜降解途徑[48,50]Fig.2 Degradation pathway of cembranoid diterpenes

3 類西柏烷二萜的生物活性

3.1 改善作物風味品質

許多作物如薄荷[52]、香椿[53]、煙草[54]等腺毛分泌物與香氣關系密切,這種關系在煙草屬作物上表現得尤為明顯。有研究人員曾對成熟期烤煙進行葉面分泌物的浸提,發(fā)現葉面分泌物的缺失對烤煙香味成分和感官質量均產生了負面影響,將提取物還原后煙葉的香氣得到了部分恢復[55],而類西柏烷二萜是煙葉葉面分泌物的主要成分,能占到分泌物總量60%左右[2],并在調制后大部分降解產生茄酮及其衍生物等多種香味成分[6],其中茄酮本身就具有很好的香氣,具有類似胡蘿卜的香味和甘草、茶樣芳香,經煙草的調制、陳化進一步降解后可產生對卷煙吃味有重要影響的茄醇、茄尼呋喃、降茄二酮等物質,其中降茄二酮具有弱的堅果香及甜香,在卷煙中可以明顯增加似可可和白肋煙一樣的香味[56]。

3.2 提高植物抗性

腺毛主要分布在植物的莖葉表面,它們的分泌物構成了一道潛在的防御害蟲的壁壘,并且這種壁壘的防御性能可以通過代謝工程學的手段進行提升。Wang等[3,57]在用代謝工程學手段對煙葉腺毛抗蟲能力的研究中發(fā)現,通過反義基因和共抑制的手段對編碼CYP450的cDNA進行下調,導致了CBT-diol的減少,同時CBT-ol得以積累增加,而植物CBT-ol的過量產生可以提高其對某些昆蟲的抗性,這可能是由于CBT-ol對這些昆蟲可以產生毒性所致。通常,包括CBT-ol在內的二萜和蔗糖酯是被植物表面的角質層所覆蓋的,但當害蟲對植株表面進行破壞時,這些非揮發(fā)性成分就會擺脫角質層的束縛而釋放到外部,從而實現抗蟲效果[58]。有時類西柏烷二萜具有殺蟲或抗蟲性,而有時情況恰恰相反,能夠積極參與昆蟲的生活周期,如CBT-ol和CBT-diol可作為活性劑,刺激煙草夜蛾產卵,然而這些活性劑對于幼蟲的生長卻具有毒害作用[59]。有研究人員評估了煙草腺毛分泌物對真菌（煙草霜霉?。┑挠绊?發(fā)現CBT-diol顯示出抗真菌活性[60-61]。

4 類西柏烷二萜的研究和應用前景與展望

在類西柏烷二萜的整個生化途徑中,有多個酶和基因可被調控,在過去的研究中,種種證據表明,通過代謝工程或基因工程學手段調控這些酶和基因控制類西柏烷二萜的代謝途徑以提高植物的天然抗蟲性、香味和香氣品質[15,62]以及將作物作為“植物工廠”生產易于回收的商業(yè)產品等方面都具有很大的研究和應用潛力。如利用基因工程學手段對作物的品質進行遺傳改良,使其釋放特定的香味,甚至可以利用作物生產天然的而非人工合成的香料。隨著人們對類西柏烷二萜代謝機理及分子調控認識的逐漸深入,一種安全的、無公害的病蟲害防治新途徑可能被發(fā)現。如利用轉基因手段使一些無西柏烷類物質產生的作物具有這種物質的分泌功能并產生抗性；或構建作物多樣性種植模式,優(yōu)化農田生態(tài)環(huán)境,充分利用類西柏烷二萜的殺蟲作用以降低同種害蟲對其它作物的危害,建立安全、和諧的農田或菜田生態(tài)系統(tǒng)等。

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Research progress on metabolic mechanism of cembranoid diterpenes and its regulation

WANG Dong, ZHANG Xiaoquan, YANG Tiezhao, XUE Gang,Li Lihua
Tobacco College of Henan Agricultural University, Zhengzhou 450002, China

Biosynthetic and metabolic pathway and regulatory factors of cembranoid diterpenes were introduced, and its application prospective on aroma-improving and insect-resistant were also discussed.Cembranoid diterpenes mainly exists in glandular trichome secretion of Nicotiana plant.It was produced through plastidic deoxyxylulose phosphate (DXP) pathway with cembratrien-ol synthase(CBTS) and cytochrome P450 oxygenase (CYP450) as catalyzer.This process was regulated by gene and various external factors.

cembranoid diterpenes; cembratrien-ol synthase; cytochrome p450 monooxygenase; aroma style; insect resistance

10.3969/j.issn.1004-5708.2014.03.019

TS413 文獻標志碼：A 文章編號：1004-5708（2014）03-0113-06

中國煙草總公司科技重點項目（110201002008）

王冬（1985—）,博士研究生,研究方向為煙草遺傳育種與生理,Email: wangdong0629@163.com

楊鐵釗（1955—）,教授,博士生導師,主要從事煙草遺傳育種研究,Email: yangtiezhao@126.com

2013-04-16