王文元，李青青，陳興，夏建軍，蔣舉興，段焰青

1 紅云紅河煙草（集團(tuán)）有限責(zé)任公司技術(shù)中心，云南昆明五華區(qū)367號(hào) 650202；2 云南師范大學(xué)，昆明市一二一大街298號(hào) 650092

離子色譜法測(cè)定煙用香精香料中的硝酸根和亞硝酸根

王文元1，李青青2，陳興1，夏建軍1，蔣舉興1，段焰青1

1 紅云紅河煙草（集團(tuán)）有限責(zé)任公司技術(shù)中心，云南昆明五華區(qū)367號(hào) 650202；2 云南師范大學(xué)，昆明市一二一大街298號(hào) 650092

對(duì)煙用香精香料中的NO3–和NO2–采用振蕩萃取，建立了快速檢測(cè)煙用香精香料中的NO3–和NO2–的離子色譜法(IC)。香精香料試樣中的NO3–和NO2–在振蕩條件下用水、二氯甲烷萃取,經(jīng)0.22 μm濾膜凈化，柱流速為1.0 mL/min，采用濃度梯度洗脫方式，IonPac AS11陰離子分析柱、電導(dǎo)檢測(cè)器檢測(cè)，并采用該方法測(cè)定了15個(gè)煙用香精香料樣品。結(jié)果表明：①和NO2–的檢出限、回收率、相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）及線性范圍分別為0.010和0.006 μg/mL，95.4%和90.6%，3.42%和4.61%，0.06～ 6.0 μg/mL和 0.02～2.0 μg/mL；② 測(cè)定的15個(gè)煙用香精香料樣品中NO3–的檢出率53.3%，NO2–的檢出率40.0%。該方法具有快速、靈敏、簡(jiǎn)便等優(yōu)點(diǎn)，適合于煙用香精香料樣品中NO3–和NO2–的測(cè)定。

卷煙；離子色譜法；亞硝酸根； 硝酸根；煙用香精香料

“晾曬煙煙葉中NO3–和NO2–與煙草特有亞硝胺(NNN、NAT、NNK、NAB)有顯著的相關(guān)性，NNN和NNK是強(qiáng)烈的動(dòng)物致癌劑，NNK和NNN致癌也已成為腫瘤病因?qū)W研究的重要課題之一。煙草中NO3–和NO2–還是煙氣中的氮氧化物主要來(lái)源。煙用香精香料是卷煙生產(chǎn)中通常使用的物質(zhì)，部分香原料中可能含有一定量的NO3–和NO2–，可能對(duì)卷煙有一定影響。目前，煙葉中NO3–和NO2–的檢測(cè)分析方法已有一些報(bào)道[1-2]，而對(duì)于煙用香精香料中NO3–和NO2–的檢測(cè)技術(shù)方法未見(jiàn)報(bào)道，研究香精香料中NO3–和NO2–的監(jiān)測(cè)及分析方法具有重要的意義。國(guó)內(nèi)外檢測(cè)硝酸根、亞硝酸根的方法有：分光光度法[3-6]、發(fā)光分析法[7-9]、電分析法[10]、連續(xù)流動(dòng)分析儀法[11]等。這些方法大多需對(duì)樣品進(jìn)行分離富集、靈敏度較低，而且所用的有機(jī)萃取試劑通常對(duì)操作人員健康有害，不利于推廣應(yīng)用；而離子色譜法因其快速、準(zhǔn)確、靈敏度高、所用試劑無(wú)毒害等特點(diǎn)優(yōu)勢(shì)，一直倍受?chē)?guó)內(nèi)外學(xué)者的關(guān)注。本文建立了離子色譜法測(cè)定煙用香精香料中NO3–和NO2–的新檢測(cè)方法。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

(1)材料：KOH淋洗液(色譜純，戴安公司)，15種煙用香精香料樣品(市售)，水相濾膜(0.22μm，邁博瑞生物膜技術(shù)（南通）有限公司)；

(2)試 劑：NO3–、NO2–質(zhì)量濃度均為1000 mg/L(國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)研究中心)，貨號(hào)分別為GBW(E)080522、GBW(E)081223；按下列濃度范圍配制標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，以水為溶劑配制，NO3–為： 0.06 mg/L、0.6 mg/L、1.5 mg/L、3.0 mg/L、6.0 mg/L，NO2–為：0.02 mg/L、0.20 mg/L、0.50 mg/L、1.0 mg/L、2.0 mg/L；

(3)儀器：ICS–3000型離子色譜儀(美國(guó)戴安公司)，Mettler AE 163型電子天平(感量0.1 mg，瑞士梅特勒–托利多公司)，Millipore Simplicity型超純水器(美國(guó)MILLIPORE公司)，普通搖床(型號(hào)：3017，德國(guó)GFL公司) 。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 香精香料樣品的前處理

水溶性樣品：稱(chēng)取約0.5 g的試樣，精確至0.0001 g，置于100 mL錐形瓶中，加入20 mL水，具塞后置于振蕩器上以180 r/min的頻率振蕩25 min，將萃取液轉(zhuǎn)移至50 mL容量瓶中，用去離子水定容至刻度，搖勻后靜置，經(jīng)0.22 μm 水相濾膜過(guò)濾后待測(cè)；水不溶性樣品：稱(chēng)取約0.5 g的試樣，精確至0.0001 g，置于100 mL錐形瓶中，加入3 mL二氯甲烷分散后再向其中準(zhǔn)確加入20.00 mL水，具塞后置于振蕩器上以180 r/min的頻率振蕩25 min，靜置后取水相澄清液經(jīng)0.22 μm 水相濾膜過(guò)濾后待測(cè)[12]。

1.2.2 色譜分析條件

色譜柱：IonPac AS11 4×250 mm（分析柱）；IonPac AG11 4×50 mm（保護(hù)柱）； 抑制器：ASRS 300；電導(dǎo)檢測(cè)器池溫：35℃；柱流速：1.0 mL/min；柱溫：30 ℃；進(jìn)樣量：25 μL。流動(dòng)相A：KOH溶液；流動(dòng)相B：水。洗脫梯度：0.0～32.5 min 流動(dòng)相 A(6 mmol/L),流動(dòng)相 B(水 )；33.0～36.0 min 流動(dòng)相A(35 mmol/L),流動(dòng)相B(水)；36.5～41.5 min流動(dòng)相A(6 mmol/L),流動(dòng)相B(水)。采用比較標(biāo)樣保留時(shí)間法定性，采用外標(biāo)法峰面積定量。

2 結(jié)果與討論

2.1 樣品前處理?xiàng)l件優(yōu)化

2.1.1 萃取溶劑的選擇

試驗(yàn)采用振蕩萃取的方式對(duì)香精香料樣品中的NO3–和NO2–進(jìn)行提取，固定樣品的稱(chēng)樣量0.5 g、萃取溶劑體積30 mL、振蕩萃取15 min條件不變，按照試驗(yàn)方法，分別考察了去離子水，5 mmol/L、10 mmol/L、20 mmol/L HCl溶液，5 mmol/L、10 mmol/L、20 mmol/LNaOH溶液等溶劑的萃取效果，結(jié)果表明：當(dāng)去離子水作為萃取溶劑時(shí)，NO3–和NO2–的測(cè)定結(jié)果RSD最小，萃取效率優(yōu)于其它萃取溶液，因而選擇去離子水作為本試驗(yàn)的萃取溶劑；同時(shí)考察了5 mL、10 mL、20 mL、30 mL、40 mL等不同體積萃取溶劑的萃取效率，結(jié)果表明：當(dāng)去離子水的萃取體積為5-10 mL時(shí)，NO3–和NO2–的測(cè)定結(jié)果有上升趨勢(shì)，表明目標(biāo)物質(zhì)沒(méi)有萃取完全，而萃取體積為20-40 mL之間時(shí)，NO3–和NO2–的測(cè)定結(jié)果基本一致，因此，該部分工作獲得了去離子水的最佳用量為20 mL。

2.1.2 萃取方式和萃取時(shí)間

按照試驗(yàn)方法，固定樣品的稱(chēng)樣量0.5 g、萃取溶劑體積20 mL、萃取20 min等條件不變，分別采用超聲萃取和振蕩萃取兩種方式對(duì)對(duì)香精香料樣品中的NO3–和NO2–進(jìn)行提取，試驗(yàn)結(jié)果表明：與振蕩萃取方式相比，采用超聲萃取方式NO3–和NO2–的測(cè)定結(jié)果略低小、RSD值較大，該現(xiàn)象原因可能是由于超聲振蕩萃取時(shí)，溫度有所升高，NO3–和NO2–轉(zhuǎn)化為其它物質(zhì)造成的，試驗(yàn)選擇振蕩萃取方式來(lái)提取待測(cè)目標(biāo)物質(zhì)NO3–和NO2–；同時(shí)試驗(yàn)考察了5 min，10 min，15 min，25 min，35 min等不同振蕩時(shí)間對(duì)萃取液效果的影響，獲得了最佳振蕩萃取時(shí)間為25 min。

2.2 離子色譜儀條件的選擇

本實(shí)驗(yàn)工作采用Dionex Ionpac ASl1-HC陰離子交換柱，該柱的特點(diǎn)是用來(lái)分析復(fù)雜樣品大量的無(wú)機(jī)離子和有機(jī)陰離子，適用于氫氧化鈉或氫氧化鉀作為淋洗液。由于淋洗液的組成對(duì)NO3–和 NO2–的分離效果及洗脫時(shí)間影響很大，因此在淋洗液流速固定的情況下，試驗(yàn)考察了氫氧化鉀溶液濃度對(duì)分離效果的影響。結(jié)果表明：采用氫氧化鉀溶液等度洗脫時(shí)，NO2–和NO3–的分離度較低，同時(shí)由于香精香料樣品較為復(fù)雜，含有大量的有機(jī)酸根離子，樣品在AS11-HC的殘留較多，不僅污染柱子，且會(huì)縮短柱子的使用壽命。因而，試驗(yàn)考察了梯度濃度淋洗方式，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：在0.0～32.5 min時(shí)選用氫氧化鉀溶液濃度6 mmol/L，33.0～36.0 min氫氧化鉀溶液濃度35 mmol/L，36.5～41.5 min 氫氧化鉀溶液濃度6 mmol/L洗脫時(shí)可以實(shí)現(xiàn)NO3–和NO2–及其它陰離子的有效分離，進(jìn)而可保護(hù)色譜柱、延長(zhǎng)其使用壽命。

在上述優(yōu)化條件下，NO2–和NO3–的標(biāo)準(zhǔn)溶液及香精香料樣品的色譜圖分別見(jiàn)圖1，圖2。

圖1 標(biāo)準(zhǔn)樣品的色譜圖Fig.1 Chromatogram of standard samples

圖2 香精香料樣品的色譜圖Fig.2 Chromatogram of flavor spices samples

2.3 工作曲線和檢出限

按照實(shí)驗(yàn)方法，配制NO3–為：0.06 mg/L～6.0 mg/L，NO2–為：0.02 mg/L、～2.0 mg/L標(biāo)準(zhǔn)溶液，上離子色譜儀進(jìn)行分析，獲得NO3–、NO2–的積分峰面積，以峰面積作為縱坐標(biāo)，NO3–、NO2–濃度作為橫坐標(biāo)分別建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，線性回歸方程分別為：Y=0.0811X+0.0071，Y=0.1098X–0.0069，決定系數(shù)R2分別為0.9988和0.9990，滿(mǎn)足外標(biāo)法定量要求。方法的檢出限（LOD）選擇用同一樣品重復(fù)進(jìn)樣11次，由測(cè)得的濃度值統(tǒng)計(jì)出標(biāo)準(zhǔn)偏差，LOD以3倍標(biāo)準(zhǔn)偏差求得：NO3–和NO2–分別為 0.010 μg/mL、0.006μg/mL。

2.4 精密度和回收率

按照實(shí)驗(yàn)方法，考察了同一樣品重復(fù)性的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD%)，由表1中數(shù)據(jù)看出，本方法具有良好的精密度。方法的回收率實(shí)驗(yàn)采用基質(zhì)加標(biāo)法，在樣品中加入NO3–和NO2–標(biāo)準(zhǔn)品，按照實(shí)驗(yàn)方法操作，測(cè)得低、中、高加標(biāo)3個(gè)水平下的NO3–和NO2–含量值，每個(gè)水平平行測(cè)定3次；測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表1，NO3–和NO2–的平均回收率分別為95.4%，90.6%。

表1 方法的檢出限、精密度和回收率Tab.1 Detection limit,precision and recovery rate

2.5 實(shí)際樣品的檢測(cè)結(jié)果

采用該方法分析了30種煙用香精香料樣品，結(jié)果（表2）表明，30種煙用香精香料樣品中的含量(μg/g)范圍為：NO3–：0～16.25，NO2–：0～ 0.92。食品衛(wèi)生要求嚴(yán)格控制硝酸根和亞硝酸根的含量，一般NO3–含量小于 289 μg/g，NO2–不得超過(guò) 33 μg/g[13]，由數(shù)據(jù)可以看出，煙用香精香料中硝酸根和亞硝酸根的含量均遠(yuǎn)小于食品衛(wèi)生限量要求。

表2 香精香料樣品中NO3–、NO2– 分析結(jié)果 μg/g Tab.2 NO3–、NO2–in flavor spices samples

3 結(jié)論

本文建立了離子色譜法測(cè)定煙用香精香料中的NO3–和NO2–含量的方法，采用該方法測(cè)定了15個(gè)煙用香精香料樣品。結(jié)果表明：①NO3–和NO2–的檢出限、回收率、相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD%）及線性范圍分別為0.010和0.006 μg/mL，95.4%和90.6%，3.42%和4.61%，0.06～6.0 μg/mL和0.02～2.0 μg/mL；②普查分析的30個(gè)煙用香精香料樣品中NO3–和NO2–的含量均遠(yuǎn)小于食品衛(wèi)生限量要求。該方法具有快速、靈敏、簡(jiǎn)便等優(yōu)點(diǎn)，適合于煙用香精香料樣品中NO3–和NO2–的測(cè)定。

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Determination of nitrate and nitrite in tobacco casing and flavors by ion chromatography

WANG Wenyuan1，LI Qingqing2，CHEN Xing1，XIA Jianjun1，JIANG Juxing1，DUAN Yanqing1
1 Technology Center,Hongyun and Honghe Tobacco (Group) Co.,Ltd.,Kunming 650202,China；2 Yunnan Normal University，Kunming 650092，China

A method for simultaneously determiningin tobacco casing and flavors was developed based on ion chromatography(IC) and oscillation extraction.NO3-and NO2–in casing and flavors were dealt with oscillation extraction by utilizing water and dichloromethane.They were purified through membrane ( 0.22 μm) with column flow rate of 1 mL /min.and radient elution was performed.The samples were separated on an Ion Pac AS 11 column and detected with an electrical conductivity detector.Results showed that: ① Limits of detection ofwere between 0.010 and 0.006 μg/mL,with recovery rate ranging from 90.6% to 95.4% and RSDs from3.42% to 4.61%,and linear range of 0.06 to 6.0 μg/mL and 0.02 to 2.0 μg/mL，respectively.② NO3-and NO2-in 15 tobacco casing and flavor samples were detected with detection rate of 53.3% and 40.0%.The method was proved to be applicable in determiningin tobacco casing and flavors as timesaving,accurate and simple to process.

cigarette; Ion chromatography; nitrite; nitrate; tobacco flavor

10.3969/j.issn.1004-5708.2014.02.004

TS411.1 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號(hào)：1004-5708（2014）02-0030-04

紅云紅河集團(tuán)科技項(xiàng)目“HYHH2012HX01”；云南中煙工業(yè)有限責(zé)任公司項(xiàng)目(2011JC08)；國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（No.NSFC31160432）

王文元(1980—)，工程師,碩士,主要從事煙草化學(xué)研究工作，Email:wwy13202@sohu.com

段焰青(1973—)，高級(jí)工程師,博士,主要從事煙草化學(xué)與品質(zhì)研究，Email:88084159@qq.com

2013-07-23