呂昕謠，趙 穎，趙國淼，曾燕如*，宋緒忠，楊 華

（1.浙江農(nóng)林大學(xué) 亞熱帶森林培育國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室培育基地，浙江 臨安 311300；2.浙江省舟山市林業(yè)科學(xué)研究院，浙江 舟山 316000；3.浙江省林業(yè)科學(xué)研究院，浙江 杭州 310023）

普陀樟（Cinnamomum japonicumvar.chenii）系樟科樟屬常綠喬木，為舟山海島特有瀕危植物。集中分布在舟山市普陀區(qū)的普陀山、朱家尖及其毗鄰的懸水小島上，除此之外的其他區(qū)域均未見有該樹種的天然分布[1]。普陀樟木材堅(jiān)實(shí)致密，紋理通直，耐腐，耐水濕，是優(yōu)良的用材樹種；且根系發(fā)達(dá)，抗風(fēng)性強(qiáng)，且兼具耐鹽堿、耐干旱瘠薄等特性，適應(yīng)性廣，非常適宜沿海地區(qū)栽種。而目前卻缺乏對(duì)野生普陀樟致瀕原因等各方面的足夠了解，難以實(shí)施有效的遺傳保育。

相關(guān)序列擴(kuò)增多態(tài)性（Sequence-related amplifiedpolymorphism, SRAP）是Li和Quiros[2]開發(fā)的分子標(biāo)記技術(shù)，該技術(shù)通過獨(dú)特的引物設(shè)計(jì)對(duì)開放閱讀框（Open reading frames, ORFs）進(jìn)行擴(kuò)增，因個(gè)體不同以及物種的內(nèi)含子、啟動(dòng)子與間隔區(qū)長度不等而產(chǎn)生多態(tài)性[3]。Ferriol等[4]在觀賞南瓜（Cucurbita moschata）中利用SRAP和AFLP兩種分子標(biāo)記進(jìn)行遺傳多樣性實(shí)驗(yàn)，結(jié)果與AFLP標(biāo)記相比，SRAP標(biāo)記結(jié)果更接近其性狀變異。Budak[5]等對(duì)野牛草（Buchloe dactyloides）進(jìn)行ISSR（Inter-simple Sequence Repeat）、SSR（Simple Sequence Repeat）、RAPD（Random Amplified Polymorphic DNA）和SRAP等4種分子標(biāo)記的遺傳多樣性研究，結(jié)果SRAP表現(xiàn)出更豐富的遺傳多樣性，是區(qū)分能力最強(qiáng)的標(biāo)記。與其他分子標(biāo)記相比，SRAP標(biāo)記技術(shù)具有重復(fù)性好、多態(tài)性高、操作簡便、共顯性、易測序、引物具有通用性等優(yōu)越性，已逐漸成為種質(zhì)資源研究的有效技術(shù)，近年來多應(yīng)用于遺傳多樣性分析[5]、遺傳圖譜構(gòu)建[6]以及重要性狀標(biāo)記[7]等諸多領(lǐng)域。

目前，有關(guān)普陀樟分子標(biāo)記方面的研究尚未見報(bào)道。本研究建立了普陀樟的SRAP-PCR反應(yīng)體系，可為進(jìn)一步開展普陀樟的遺傳多樣性及相關(guān)遺傳研究提供技術(shù)支撐，也可為普陀樟基因組分析、分子標(biāo)記輔助育種等奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

新鮮健康的普陀樟葉片樣品7份采自舟山群島不同島嶼，帶回實(shí)驗(yàn)室后清水洗凈，放置－40℃冰箱保存待用。

表1 SRAP 引物序列Table1 Sequences of SRAP primers

Taq DNA聚合酶（5U/μL）購自上海申能博彩生物科技有限公司；dNTP、DNA Marker（Fermentas）、SRAP 引物（表1）等均購自生工生物工程（上海）有限公司。

1.2 方法

1.2.1 基因組DNA的提取與檢測 采用改良CTAB方法結(jié)合TNE的方法[8]提取普陀樟基因組DNA。提取的DNA用1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA的完整性，用紫外分光光度計(jì)（NanoDrop 1000 Spectrophotometer，美國）測定A260、A280，并計(jì)算兩者的比值，以檢驗(yàn)DNA的質(zhì)量，并根據(jù)測定的濃度將DNA稀釋到10 ng/μL，－20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 SRAP-PCR反應(yīng)體系的建立 基于劉浩凱等優(yōu)化的適用于榧樹的SRAP分析方法（含PCR產(chǎn)物電泳）[9]采用L16（45）正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)，對(duì)可能影響普陀樟SRAP-PCR反應(yīng)的Mg2+濃度、dNTPS、Taq DNA聚合酶、引物（F2/R4）和模板DNA用量進(jìn)行5因素4水平正交試驗(yàn)（表2）。反應(yīng)總體積為20 μL，實(shí)驗(yàn)重復(fù)4次，以確定最佳體系組合。

表2 SRAP-PCR正交設(shè)計(jì)試驗(yàn)L16（45）Table2 L16（45）orthogonal design for SRAP-PCR reaction

反應(yīng)程序?yàn)?4℃預(yù)變性5 min；共5個(gè)循環(huán)，每個(gè)循環(huán)94℃變性45s，35℃退火45s，72℃延伸1 min；隨后35個(gè)循環(huán)，每個(gè)循環(huán)94℃變性45 s，50℃退火45s，72℃延伸1 min；最后72℃延伸5 min，4℃保存。擴(kuò)增產(chǎn)物加入3 μL Loading dye混合均勻，以3 000 bp DNA Ladder為參照標(biāo)準(zhǔn)，采用8%非變性聚丙烯酰胺凝膠進(jìn)行電泳，160V電泳85 min。電泳結(jié)束后采用銀染法進(jìn)行染色，顯色后將凝膠置于可見光燈箱上觀察電泳結(jié)果，并拍照保存。

隨機(jī)選取F6/R7和F6/R8兩個(gè)引物組合，利用篩選出的普陀樟最優(yōu)體系，對(duì)30份普陀樟DNA材料進(jìn)行PCR擴(kuò)增，檢測反應(yīng)體系的穩(wěn)定性。

利用優(yōu)化設(shè)計(jì)確定的SRAP-PCR的最佳反應(yīng)體系，用表1所示的10個(gè)正向引物和10個(gè)反向引物組合的100對(duì)引物，對(duì)4個(gè)不同普陀樟樣品進(jìn)行引物組合篩選。

2 結(jié)果與分析

2.1 普陀樟基因組DNA的提取

經(jīng)紫外分光光度計(jì)測定，8份普陀樟DNA樣品OD260/OD280值均在1.8 ～ 2.0；1%瓊脂糖電泳檢測結(jié)果（圖1）顯示，DNA條帶完整清晰，無拖尾現(xiàn)象，符合分子標(biāo)記擴(kuò)增對(duì)DNA的要求。

圖1 普陀樟DNA的瓊脂糖電泳檢測圖Figure1 Argarose electrophoretogram of genomic DNAs extracted in C.japonicum var.chenii

2.2 SRAP-PCR反應(yīng)體系的優(yōu)化

從正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以看出，不同的PCR組份組合擴(kuò)增效果具有明顯的差異，其中1 ～ 4、7、8號(hào)擴(kuò)增效果不好，11、12、15、16號(hào)位點(diǎn)較清楚，但位點(diǎn)數(shù)少，均予以淘汰（圖2）。仔細(xì)觀察發(fā)現(xiàn)，9、10號(hào)比13、14號(hào)擴(kuò)增的位點(diǎn)數(shù)多，而且更加清晰。直觀分析10號(hào)組合為佳，9號(hào)組合次之，二者間無明顯差異。慮到9號(hào)組合中 Taq 酶的用量為 2 U，因此本著經(jīng)濟(jì)有效的原則，最終確定10號(hào)組合為最理想的SRAP-PCR反應(yīng)體系，即20 μL PCR體系包括 2.5 mmol/L Mg2+、0.2 mmol/L dNTPs、1.5 U Taq DNA聚合酶、0.4 μmol/L引物、10 ng模板DNA、2 μL 10×PCR buffer。

圖2 正交實(shí)驗(yàn)產(chǎn)物電泳圖Figure2 Electrophoretogram of PCR products based on the orthogonal design

2.3 SRAP-PCR體系的穩(wěn)定性檢測及引物篩選

SRAP-PCR體系的穩(wěn)定性檢測表明，擴(kuò)增譜帶清晰而穩(wěn)定，位點(diǎn)數(shù)多，且多態(tài)性豐富（圖3），說明建立的反應(yīng)體系具有良好的穩(wěn)定性，適合于普陀樟的SRAP-PCR分析。利用該反應(yīng)體系，從100對(duì)引物組合（表1）中篩選出20對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物清晰、多態(tài)性較好的引物（F2R7、F3R7、F4R7、F5R7、F6R7、F8R7、F9R7、F5R1、F5R8、F6R8、F9R6、F2R1、F4R2、F5R1、F5R2、F3R3、F4R3、F6R4、F10R4、F5R5），用于普陀樟后續(xù)遺傳多樣性分析。

圖3 SRAP反應(yīng)體系穩(wěn)定性檢測（引物對(duì)：上：F6R7；下：F6R8）Figure3 Testing of the SRAP reaction (Primer pairs: F6R7 (up) and F6R8(down))

3 結(jié)論與討論

SRAP分子標(biāo)記是基于PCR反應(yīng)的一種標(biāo)記技術(shù)，它的結(jié)果受到體系中各個(gè)因素的影響，且各因素之間還存在相互作用，因此各因素之間的配比只有達(dá)到最佳狀態(tài)時(shí)，才能得到穩(wěn)定、可重復(fù)的擴(kuò)增結(jié)果。不同植物適合的SRAP 反應(yīng)體系不同，所以需要根據(jù)物種的不同對(duì)反應(yīng)體系進(jìn)行優(yōu)化。

本實(shí)驗(yàn)采用了一次性正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)篩選反應(yīng)體系，并對(duì)該體系穩(wěn)定性進(jìn)行了檢測及初步應(yīng)用，結(jié)果顯示擴(kuò)增位點(diǎn)清晰穩(wěn)定，多態(tài)性好，重復(fù)性強(qiáng)，說明本研究建立的普陀樟SRAP-PCR體系穩(wěn)定可靠、擴(kuò)增效率高，為日后普陀樟基因組分析、分子標(biāo)記輔助育種、遺傳多樣性研究等奠定了基礎(chǔ)。

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