李 凱，高 鳳，冷亞書，趙國慶，李龍云

（吉林大學(xué)中日聯(lián)誼醫(yī)院，吉林 長春130033）

本實驗針對大鼠重度失血性休克模型，采用臨床常用的混合輸血輸液策略，對比重度失血性休克及兩種液體復(fù)蘇方案對腎臟功能的影響，及與BSC1、AQP2蛋白的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 材料 實驗動物為清潔級雄性SD大鼠，體重220－250g，由吉林大學(xué)動物實驗中心提供。鹽酸氯胺酮注射液，乳酸鈉林格氏液，羥乙基淀粉（130／0.4，萬汶，費森尤斯卡比）.AQP2、BSC1抗體為兔抗鼠抗體和辣根過氧化物標(biāo)記羊抗兔IgG多克隆抗體購自Sigma公司；SP免疫組化試劑盒購自寶生物有限公司。全自動生化分析儀及比重儀購自徐州美康電子設(shè)備有限公司。

1.2 方法

1.2.1 急性重度失血性休克模型的建立[1]與分組實驗將雄性SD大鼠24只，隨機分為3組，每組8只。實驗前12h禁食、自由飲水。腹腔注射氯胺酮100mg／kg麻醉后，右側(cè)股動脈、股靜脈插管，股動脈插管經(jīng)三通管連接水銀血壓計和玻璃注射器，供觀察血壓，經(jīng)插管注射肝素鈉生理鹽水（500U、kg）抗凝，股靜脈插管供輸血輸液，術(shù)畢，動物穩(wěn)定10 min，。C組僅行股動靜脈插管，其余兩組經(jīng)股動脈20min內(nèi)放血35%，使平均動脈壓（MAP）低于40 mmHg，60min后按不同方案輸入不同復(fù)蘇液體，維持MAP在80mmHg 30min?？p合血管，徹底止血后，縫合切口，保溫蘇醒。

1.2.2 標(biāo)本采集 術(shù)后24h再次麻醉采樣。采集術(shù)前和術(shù)后24h尿液樣本，記錄尿量，檢測尿比重。采集術(shù)前及術(shù)后24h的血液送檢肌酐（Cr）及尿素氮（BUN），取血后迅速摘除大鼠左側(cè)腎臟，將取出的左腎標(biāo)本置于冰上沿正中線分割成左右兩部分，其中一部分標(biāo)本取材后放入10%福爾馬林溶液中固定以行病理學(xué)及免疫組織化學(xué)檢測，組織切片HE染色，光學(xué)顯微鏡觀察腎組織病理變化。依據(jù)Paller法[2]對腎小管損害程度進行評分。另一部分將腎臟于顯微鏡下分離出皮質(zhì)和髓質(zhì)后馬上放入液氮中凍存，1h后置于－80℃冰箱保存以行Western blot檢測。

1.2.3 生化指標(biāo)檢測 標(biāo)本集齊后生化分析儀測定BUN和Cr，比重計測量尿液比重。

1.2.4 免疫組織化學(xué)檢測BSC1、AQP2的表達腎臟石蠟標(biāo)本切成3μm切片，經(jīng)二甲苯脫蠟，梯度酒精水化后按SP試劑盒說明書操作。在200倍光鏡下觀察以細胞膜顯色棕黃色顆粒為陽性。

1.2.5 蛋白印跡（Western blot）腎組織加入含蛋白酶抑制劑的蛋白裂解液（250mM suCrose包含1mM EDTA，20μg／mlPMSF，1μg／ml pepstatinA，和1μg／ml leupetin pH 7.4）后勻漿（電動勻漿儀1 250rpm，5s），提取膜蛋白。應(yīng)用蛋白分析試劑（Bio－Rad，USA）測定總蛋白濃度，50μg蛋白質(zhì)溶于蛋白上樣緩沖液中煮沸5min，12%的聚丙烯酰胺凝膠電泳（電壓120V）30min后，100V電泳1 h，將膠版上的蛋白帶轉(zhuǎn)至纖維素膜上（PVDF膜），將PVDF膜放入含5%脫脂奶粉的PBS液中于37℃下封閉1h，因蛋白分布的部位不同，皮質(zhì)檢測AQP2，髓質(zhì)檢測 BSC1，PBS沖洗后加入一抗（AQP2 1∶200，BSC1 1∶500）放置在搖床上4℃過夜，PBST洗膜后加入二抗（羊抗兔，稀釋度1：10000）孵育1h，加入PBS洗膜后掃描照相。

2 結(jié)果

2.1 尿量和尿比重改變 見表1。

表1 失血性休克損傷術(shù)前和術(shù)后24h尿比重及尿量變化（n＝8，±s）

表1 失血性休克損傷術(shù)前和術(shù)后24h尿比重及尿量變化（n＝8，±s）

＊與術(shù)前比較P＜0.05。

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2.2 血清BUN和Cr變化 見表2。

表2 失血性休克損傷術(shù)前和術(shù)后24hBUN和Cr變化（n＝8，±s）

表2 失血性休克損傷術(shù)前和術(shù)后24hBUN和Cr變化（n＝8，±s）

＊與術(shù)前比較P＜0.05。

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2.3 腎組織形態(tài)學(xué)改變見圖1，C組：腎單位結(jié)構(gòu)完整，腎小球和腎小管未見明顯異常；LR及HES組：腎小球輕度淤血，間質(zhì)充血水腫，少量腎小管上皮細胞水腫，空泡變性，刷狀緣扁平、皺縮、少量核深染、裸露，有少量中性粒細胞侵潤。腎小管Paller評分：與C組相比，HES組和LR組評分均顯著增加（P＜0.05）。但 HES組和LR組間無差異（P＞0.05），見圖2。

圖1 腎組織形態(tài)學(xué)改變（HE×400）

圖2 腎小管Paller評分，＊與C組比較P＜0.05，#與LR組比較P＞0.05）。

2.4 腎組織AQP2，BSC1免疫組化結(jié)果 見圖3、4，腎臟集合管細胞膜和髓袢升支粗段細胞膜有棕黃染色，分別為AQP2和BSC1表達。與C組比較，LR組和HES組BSC1、AQP2在腎臟缺血－再灌注損傷后染色較淺，HES組染色深于LR組。

2.5 腎組織AQP2，BSC1蛋白表達變化 Western blot結(jié)果示見圖5，AQP2的分子量位于29kDa和35－50kDa的蛋白帶，BSC1的分子量位于42kDa的蛋白帶。GAPDH的分子量位于45kDa的蛋白帶。與C組比較，LR組和HES組AQP2，BSC1表達顯著下調(diào)，HES組表達高于LR組。

圖3 腎臟內(nèi)髓部集合管AQP2的表達

圖4 腎臟髓袢升支粗段BSC1表達

圖5 Western blot法檢測蛋白表達，＊與C組比較P＜0.05，#與LR組比較P＜0.05。

3 討論

嚴重創(chuàng)傷易導(dǎo)致急性失血休克，失血量達30%就可能危及患者的生命，嚴重失血性休克后短期內(nèi)不積極救治死亡率達32.6%－59.5%[3]。目前休克后復(fù)蘇液體主要有晶體液和膠體液，由于晶體液和膠體溶液均不具備攜氧能力，且缺乏血小板和凝血因子，如果不復(fù)合輸注血制品，兩種液體的輸注量必然增大，進而引起凝血功能障礙，離子紊亂及加重腎功能障礙。以往的研究多為不復(fù)合輸血[1，4]，其結(jié)果不符合臨床實際，參考價值大大降低。本研究選擇了臨床常用的復(fù)合輸血輸液方案，進行了不同方案差異的比較。

水通道蛋白是與水通透有關(guān)的細胞膜轉(zhuǎn)運蛋白，迄今已從哺乳動物中鑒定的水通道共有13種（AQP0～12）[5]，它們分布于不同的組織器官中，分別介導(dǎo)不同類型細胞膜的跨膜水轉(zhuǎn)運。AQP2只存在于腎臟，是腎臟集合管上皮細胞調(diào)節(jié)集合管對水通透性的主要水通道蛋白[6]。由于腎臟鈉水重吸收常為偶合過程，BSC1具有回吸收 Na＋、Cl－、K＋的功能，并參與尿液濃縮的過程[2]，二者在腎臟缺血－再灌注損傷后表達顯著減低，與缺血時間呈正相關(guān)[7]，其與失血性休克繼發(fā)的腎臟損傷的關(guān)系值得關(guān)注。

BUN、Cr是判定腎功能損傷嚴重程度的重要指標(biāo)，能夠直接反映腎細胞的受損情況。與對照組相比，失血性休克補液后，兩組大鼠都出現(xiàn)了BUN、Cr明顯升高，尿比重升高等腎功能障礙的表現(xiàn)，與腎細胞上皮細胞病理改變相吻合，而兩組間病理改變沒有差異。本研究同時顯示，失血性休克補液后，BSC1、AQP2表達下調(diào)，這表明BSC1、AQP2在失血性休克所致腎損傷中起著非常重要的作用。結(jié)果與Basile法[8]夾閉腎動脈所致腎缺血再灌注損傷模型的結(jié)論相類似，提示兩種模型的損傷機制和研究結(jié)論可以相互借鑒。

兩種輸血輸液方案間對比，常規(guī)的腎功能指標(biāo)及病理損傷沒有差異。但HES組與林格組相比，BSC1、AQP2下降程度有所減低，提示二者可能是腎臟損傷的更為敏感的指標(biāo)，而HES組比林格組在該方面的優(yōu)勢，可能與HES可穩(wěn)定內(nèi)皮細胞膜，抑制中性粒細胞的黏附，維持循環(huán)穩(wěn)定作用更為持久有關(guān)[9]。故提示臨床工作中對重度失血性休克的病人，可以更多的選擇HES與血制品一起使用。

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