房愛芳，張淦，李永海，向瑩，明長生，張偉杰(華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬同濟(jì)醫(yī)院器官移植研究所，教育部/衛(wèi)生和計劃生育委員會器官移植重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖北 武漢100039)

臨床上腎移植術(shù)后，維持期免疫抑制治療目前仍然是以鈣調(diào)磷酸酶抑制劑(CNIs)、嗎替麥考酚酯(MMF)、激素的三聯(lián)免疫抑制方案為主。CNIs的應(yīng)用大大降低了急性排斥反應(yīng)的發(fā)生，提高了移植受者的近期生存率，但因其腎毒性導(dǎo)致的移植腎慢性失功[1-2]、心血管疾病以及惡性腫瘤發(fā)生率的增高[3]，使其長期生存率的進(jìn)一步提高受到限制。尋找有利于移植物長期存活的免疫抑制方案仍是移植界面臨的主要難題之一[4]。

西羅莫司(SRL)是一種作用機(jī)制與CNIs完全不同的免疫抑制劑，具有低腎毒性[5]、抗細(xì)胞增殖、抗腫瘤[6]的特點(diǎn)，尤其是SRL具有誘導(dǎo)和維持外周免疫耐受的潛能[7-9]，因而以SRL為基礎(chǔ)的免疫抑制方案亦深受矚目。以前的研究大都聚焦于SRL和他克莫司(TAC)對調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(Treg)的影響[10-11]，但長期應(yīng)用SRL和TAC對受者調(diào)節(jié)性B細(xì)胞(Breg)的數(shù)量以及對供者特異性反應(yīng)性的影響并未見報道。為此，本研究選擇親屬活體腎移植后分別應(yīng)用以TAC及SRL為基礎(chǔ)方案的受者為研究對象，通過檢測受者外周血Treg、Breg的比例，以及受者淋巴細(xì)胞經(jīng)供者抗原刺激后分泌輔助性T細(xì)胞(Th1、Th2)的情況來探討兩種不同免疫抑制方案對腎移植受者免疫狀態(tài)的影響。

1 資料和方法

1.1 研究對象

納入2008年至2011年間親屬活體腎移植受者18例，手術(shù)前經(jīng)過醫(yī)院倫理委員會審批。18例受者均為初次移植，未使用免疫誘導(dǎo)治療。全部病例目前腎功能穩(wěn)定，根據(jù)應(yīng)用免疫抑制方案的不同分為兩組，SRL組應(yīng)用SRL+MMF+潑尼松(Pred)方案；TAC組應(yīng)用TAC+MMF+Pred方案，用藥時間均超過1年；其中SRL組8例，TAC組10例，兩組在終末期腎病病因、術(shù)前群體反應(yīng)性抗體(PRA)水平、供受者年齡、人類白細(xì)胞抗原(HLA)匹配位點(diǎn)數(shù)、熱缺血時間、冷缺血時間等方面差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(表1)。相應(yīng)的親屬活體腎移植的供者作為各組的空白對照。

表1 兩組受者的基本資料

1.2 主要試劑

人淋巴細(xì)胞分離液，購自達(dá)科為生物技術(shù)有限公司；異硫氰酸熒光素(FITC)標(biāo)記的抗人CD4，別藻藍(lán)蛋白(APC) 標(biāo)記的抗人CD25，藻紅蛋白(PE)標(biāo)記的抗人叉頭翼狀螺旋轉(zhuǎn)錄因子(Foxp3)及配套的破膜固定劑，APC標(biāo)記的抗人CD19，F(xiàn)ITC標(biāo)記的抗人CD5，PE標(biāo)記的抗人CD1d，人γ-干擾素(IFN-γ)酶聯(lián)斑點(diǎn)免疫試驗(yàn)(ELISPOT)試劑盒，人白細(xì)胞介素-10(IL-10)ELISPOT試劑盒，均購自美國eBiosciences公司。

1.3 研究方法

1.3.1人外周血單個核細(xì)胞分離

抽取腎移植受者及其供者靜脈血，用磷酸鹽緩沖液(PBS)等體積稀釋，傾斜加入到與稀釋血等體積的人淋巴細(xì)胞分離液表面，室溫、1 800 r/min離心半徑18 cm，離心30分鐘，輕輕吸取云霧狀淋巴細(xì)胞層，然后充分清洗，獲取外周血單個核細(xì)胞。

1.3.2流式細(xì)胞術(shù)檢測外周血Treg

將分離出的單個核細(xì)胞用流式buffer洗2遍，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×106個/ml，加入FITC標(biāo)記的抗人CD4、APC標(biāo)記的抗人CD25進(jìn)行細(xì)胞表面染色，經(jīng)過破膜固定處理后加入PE標(biāo)記的抗人Foxp3進(jìn)行細(xì)胞內(nèi)染色，具體操作均參照試劑說明書執(zhí)行。上機(jī)檢測，以陰性對照和同型對照設(shè)門參數(shù)，檢測CD4+CD25+Foxp3+Treg。

1.3.3流式細(xì)胞術(shù)檢測外周血Breg

將外周血單個核細(xì)胞制備細(xì)胞懸液，終濃度為1×106個/ml，加入APC標(biāo)記的抗人CD19，F(xiàn)ITC標(biāo)記的抗人CD5，PE標(biāo)記的抗人CD1d進(jìn)行細(xì)胞表面染色，上機(jī)檢測。

1.3.4ELISPOT檢測受者對供者的特異性反應(yīng)性

為探討受者對供者的特異性免疫狀態(tài)，取供者的淋巴細(xì)胞作為刺激細(xì)胞，相應(yīng)受者的淋巴細(xì)胞作為反應(yīng)細(xì)胞，行混合淋巴細(xì)胞培養(yǎng)。采用ELISPOT檢測培養(yǎng)液中分泌Th1型 (IFN-γ)、Th2型 (IL-10)細(xì)胞因子的頻數(shù)，以此判斷受者的供者特異性反應(yīng)性。Th1型及Th2型細(xì)胞因子分別選取IFN-γ和IL-10為代表。

1.3.4.1ELISPOT檢測分泌IFN-γ的細(xì)胞頻數(shù)

分別分離供、受者的淋巴細(xì)胞，其中供者的淋巴細(xì)胞作為刺激細(xì)胞，絲裂霉素C滅活(終濃度25 mg/L，37℃，水浴，30分鐘)，受者的淋巴細(xì)胞作為反應(yīng)細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×106個/ml，按1：1的比例加入已包被好的96孔板，具體操作按照人IFN-γ ELISPOT試劑盒標(biāo)準(zhǔn)操作流程進(jìn)行，設(shè)置陰性對照、陽性對照，每組2個復(fù)孔，ELISPOT讀數(shù)儀計數(shù)斑點(diǎn)數(shù)，經(jīng)供者淋巴細(xì)胞刺激后分泌IFN-γ的細(xì)胞頻數(shù)＝實(shí)驗(yàn)孔細(xì)胞頻數(shù)－陰性對照細(xì)胞頻數(shù)。

1.3.4.2ELISPOT檢測分泌IL-10的細(xì)胞頻數(shù)

方法和步驟同上，具體操作按照人IL-10 ELISPOT試劑盒標(biāo)準(zhǔn)操作，ELISPOT讀數(shù)儀計數(shù)斑點(diǎn)數(shù)，計算分泌IL-10的細(xì)胞頻數(shù)。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

采用GraphPad Prism 6統(tǒng)計軟件，本實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(x±s)表示，組間均數(shù)兩兩比較進(jìn)行t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 流式細(xì)胞儀檢測Treg結(jié)果

SRL組腎移植受者外周血CD4+CD25+Foxp3+Treg占總CD4+T細(xì)胞的(6.68±0.42)%，TAC組為(3.59±0.47)%，空白對照組為(6.59±0.36)%，SRL組和空白對照組顯著高于TAC組 (均P＜0.05)，SRL與空白對照組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。見圖1。

2.2 流式細(xì)胞儀檢測Breg結(jié)果

SRL組外周血Breg(CD19+CD5+CD1d+) 占CD19+B細(xì)胞的比例為(16.43±3.56)%，TAC組為(13.09±1.64)%，空白對照組為(16.58±1.31)%，3組之間兩兩比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(均P＞0.05)。見圖 2。

2.3 ELISPOT檢測特異性細(xì)胞因子的分泌

ELISPOT檢測SRL組分泌特異性細(xì)胞因子IFN-γ的細(xì)胞頻數(shù)為(117.00±21.54)/ 500 000、TAC組 為(126.00±24.08)/ 500 000；SRL組 和TAC組分泌特異性細(xì)胞因子IL-10的細(xì)胞頻數(shù)分別為(347.00±55.29)/ 500 000、(249.00±58.97)/500 000，兩組比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(均P＞0.05)，見圖 3。

3 討 論

SRL與TAC的化學(xué)結(jié)構(gòu)相似，但作用機(jī)制卻不同[11-12]。SRL獨(dú)特的免疫抑制機(jī)制使其不僅具有強(qiáng)大的免疫抑制作用，同時腎毒性小兼具抗腫瘤作用，并具有誘導(dǎo)和維持外周免疫耐受的潛能。國內(nèi)外大量報道SRL可以選擇性擴(kuò)增Treg，并保持其免疫抑制能力[10-11]。

在腎移植受者中，應(yīng)用環(huán)孢素和TAC會減少腎移植受者體內(nèi)Treg的數(shù)量，阻礙免疫耐受的發(fā)生[12-13]，SRL則可以在抑制效應(yīng)T細(xì)胞增殖的同時，不影響Treg的增殖和能力[14]。另外也有不少研究報道SRL能夠抑制樹突狀細(xì)胞CD86的表達(dá)，使其停留在未成熟狀態(tài)，影響其抗原呈遞能力[15]，延長移植物的生存時間[15-16]。至今，對SRL在誘導(dǎo)免疫耐受方面的猜想仍停留在SRL對Treg和樹突細(xì)胞(DC)的影響上，還未有SRL會提高腎移植受者長期生存率的報道。此外，研究表明CD19+CD5+CD1d+Breg參與移植后免疫調(diào)節(jié)，具有誘導(dǎo)和維持外周免疫耐受的作用[17-18]，關(guān)于免疫抑制劑對Breg的影響也鮮有報道。本研究旨在探討臨床移植后長期應(yīng)用SRL與TAC對腎移植受者免疫狀態(tài)的影響，為此我們檢測了受者外周血Treg、Breg以及受者淋巴細(xì)胞經(jīng)供者抗原刺激后的免疫反應(yīng)能力。

圖1 3組外周血CD4+CD25+Foxp3+ Treg流式細(xì)胞分析

圖2 3組CD19+CD5+CD1d+ Breg流式細(xì)胞分析

圖3 TAC組、SRL組分泌IFN-γ、IL-10的細(xì)胞頻數(shù)

本研究結(jié)果顯示，SRL組腎移植受者外周血CD4+CD25+Foxp3+Treg占CD4+Treg的比例顯著高于TAC組(P＜0.05)，與空白對照組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義，長期應(yīng)用TAC會降低Treg的比例，而SRL則對Treg無明顯影響；說明目前常規(guī)應(yīng)用的免疫抑制方案無益于免疫耐受的誘導(dǎo)。3組患者外周血CD19+CD5+CD1d+Breg占CD19+B細(xì)胞的比例相互之間差異無統(tǒng)計學(xué)意義，這說明不管是SRL還是TAC均不影響B(tài)reg的數(shù)量。

為進(jìn)一步探討SRL及TAC對腎移植受者免疫狀態(tài)的影響，我們應(yīng)用ELISPOT檢測兩組受者外周血淋巴細(xì)胞經(jīng)供者特異性淋巴細(xì)胞刺激后分泌Th1、Th2的細(xì)胞頻數(shù)。目前認(rèn)為，Th1細(xì)胞主要分泌IFN-γ、IL-2，與細(xì)胞排斥反應(yīng)有關(guān)，而Th2細(xì)胞主要分泌IL-4、IL-10，可以抑制Th1細(xì)胞的排斥反應(yīng)，有助于誘導(dǎo)耐受，同時臨床上產(chǎn)生耐受的受者體內(nèi)Th2細(xì)胞因子占優(yōu)勢?；诖?，我們分別檢測了分泌IFN-γ(Th1)、IL-10(Th2)的細(xì)胞頻數(shù)。結(jié)果表明，兩組受者特異性分泌兩種細(xì)胞因子的細(xì)胞頻數(shù)差異亦無統(tǒng)計學(xué)意義，提示兩組受者外周血淋巴細(xì)胞對供者特異性刺激后反應(yīng)性無差異。

總之，長期應(yīng)用SRL對腎移植受者外周血Treg無明顯影響，而TAC則顯著減少Treg比例，但兩者對CD19+CD5+CD1d+Breg均無影響。兩組受者外周血淋巴細(xì)胞對其相應(yīng)供者外周血淋巴細(xì)胞特異性刺激后分泌IFN-γ、IL-10的細(xì)胞頻數(shù)無顯著差異，推測兩種免疫抑制方案對腎移植受者體內(nèi)免疫狀態(tài)的影響無顯著差異。由于本研究例數(shù)有限，需要增加樣本量進(jìn)一步證實(shí)此結(jié)論。