凡責(zé)艷， 木佳， 毛自朝， 官會林

（1.云南師范大學(xué) 能源與環(huán)境科學(xué)學(xué)院，云南 昆明650092；2.云南農(nóng)業(yè)大學(xué) 農(nóng)業(yè)與生物技術(shù)學(xué)院，云南 昆明650201）

可得膠（curdlan），又稱熱凝膠，是農(nóng)桿菌ATCC31749菌株所產(chǎn)生的一種胞外多糖，由400～500個D－葡萄糖以β－（1→3）糖苷鍵線性連接而成的一類葡聚糖［1－2］；由于其具有凝膠強度高、熱成型后不可逆、無色、無味和保水力強等特性，已被廣泛應(yīng)用于農(nóng)業(yè)、建筑及化工行業(yè)等多個領(lǐng)域，在食品、化妝品等中用為添加劑；其抗HIV、抗腫瘤、提高免疫力活性等特性使其具有廣闊的醫(yī)用前景［3－4］.目前全球可得膠產(chǎn)品約有60億美元的市場份額，并預(yù)計以每年10%左右的需求速度增長.相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，大多數(shù)細菌胞外多糖的合成受控于新近發(fā)現(xiàn)環(huán)二鳥苷酸（c－di－GMP），該c－di－GMP是細菌中參與各種生理功能調(diào)節(jié)的第二信使［5－7］，其合成及分解涉及三個蛋白質(zhì)域，其中GGDEF結(jié)構(gòu)域為c－di－GMP合成中的二鳥核苷酸環(huán)化酶，而 EAL 和 HD－GYP域是c－di－GMP分解中的磷酸二酯酶［5，8－9］.細菌中廣泛分布有 這三個結(jié)構(gòu)域［5－6，9］，具有GGDEF、EAL、及HDGYP結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)參與到細菌纖維素生物合成、移動性、附著性、生物膜形成、毒力因子生產(chǎn)和致病 性［7－8，10－12］.作為細菌中的第二信使，c－di－GMP除具有上述功能外，還能夠刺激胞外多糖的生物合成［13］.大量研究表明，從綠膿桿菌（P.aeruginosa）中得到的類超化系統(tǒng)蛋白WspR具有GGDFE結(jié)構(gòu)域，有DGC活性，可促進c－di－GMP的合成［14－17］.生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，土壤農(nóng)桿菌ATCC31749含有十幾個GGDEF保守結(jié)構(gòu)域［18］.因此，如能在 ATCC31749中提高 WspR的表達活性，就能提高c－di－GMP的產(chǎn)生，從而促進胞外多糖可得膠的合成.本實驗將ATCC31749的WspR克隆到pQE81L，并轉(zhuǎn)入大腸桿菌，以確定WspR的表達是否可促進c－di－GMP的合成，下一步探究WspR在ATCC31749中作用及其對可得膠的合成調(diào)控研究提供基礎(chǔ).

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種、質(zhì)粒

土壤農(nóng)桿菌 ATCC31749、WspR cDNA模板，大腸桿菌BL21（DE3），質(zhì)粒載體pQE81L，均由云南農(nóng)業(yè)大學(xué)生物化學(xué)與分子生物學(xué)實驗室提供.

1.1.2 酶和試劑

限制性內(nèi)切酶（SalI，BamHI）和 T4DNA連接酶購自Promega公司；Tap DNA聚合酶和dNTP購自TakaRa公司；血紅素、吖啶黃、ABTS（2，2－聯(lián)氮－二（3－乙基－苯并噻唑－6－磺酸）二銨鹽）、30%過氧化氫購買于sigma公司，其他試劑均為分析純.

1.2 方法

1.2.1 引物設(shè)計與合成

根據(jù)GenBank中報道的pQE81L－WspR基因序列，設(shè)計合成含有相關(guān)酶切位點的上下游引物，并由上海生工生物工程有限公司合成.

1.2.2 目的基因的PCR擴增

根據(jù)pQE81L－WspR基因序列設(shè)計引物，上游引物：5′－GCGGATAACAATTTCACAC－3′；下游引物：5′－GCAGCACCAGGTTAGTTTCC－3′.PCR反應(yīng)體系為：WspR 的cDNA 模板2.5 μL，10×PCR buffer 5 μL（含 Mg2＋），2.5 mmol／L的dNTP 4μL，50μmol／L的上下游引物各1μL，5U／μL的Tap DNA聚合酶0.5μL，加去離子水至總體積為50μL.PCR反應(yīng)程序：94℃ 預(yù)變性5min；94℃變性30s，55℃退火30 s，72℃延伸45s，共30個循環(huán)；72℃延伸5 min.結(jié)束反應(yīng)，PCR產(chǎn)物放置于4℃冰箱，留待電泳檢測.PCR產(chǎn)物的檢測：配制1%（w／v）的瓊脂糖凝膠，取5μL的PCR產(chǎn)物pQE81L－WspR同1μL的6×Loading buffer（1mL 6×Loading buffer混有25μL的花青素）混勻上樣，所用Marker為250bp－I DNA ladder.上樣后，凝膠于1×TAE緩沖液中，120V，電泳45min.電泳結(jié)束后使用IQuant capture凝膠成像分析系統(tǒng)拍照分析.

1.2.3 WspR蛋白表達的初步檢測

1.2.3.1 WspR蛋白的誘導(dǎo)表達

將凍存的含有pQE81L－WspR的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入BL21菌株中，在LB含卡那霉素抗性固體平板上劃線活化，37℃溫箱倒置培養(yǎng)12～16h.挑取單菌落接種于LB液體培養(yǎng)基中，于37℃恒溫搖床中200rpm振蕩過夜培養(yǎng).次日，按1∶100的比例，將種子液接種于LB液體培養(yǎng)基中，200 rpm，37 ℃振蕩培養(yǎng).待OD600達到0.5～1.0時，加入0.1mol／L的IPTG至終濃度為1mmol／L，之后低溫30℃，200rpm振蕩培養(yǎng).并在培養(yǎng)0，2，4，6h后分別取樣1mL，留作SDS－PAGE電泳檢測.

1.2.3.2 WspR誘導(dǎo)表達后粗蛋白樣品的處理

將誘導(dǎo)時所取的樣品12 000rpm離心5min，棄去上清液.用無菌去離子水清洗細胞沉淀，同樣12 000rpm離心，棄上清，并重復(fù)1次.按照0.2g／mL的比例加2×Loading Buffer（其中含5%的巰基乙醇），混勻.混勻后的樣品于沸水中煮15min，之后液氮速凍，如此重復(fù)3次.解凍后，12 000rpm 離心3min.留待SDS－PAGE檢測.

1.2.4 c－di－GMP的粗提取

將菌株BL21pQE81L－WspR、BL21 pQE81L分別用接種環(huán)蘸取一定量在已倒好的LB固體培養(yǎng)基上劃板培養(yǎng)，37 ℃恒溫搖床中180rpm培養(yǎng)12h，然后分別在兩菌株平板上挑取一個單菌落接于5mL LB液體培養(yǎng)基中（培養(yǎng)菌株BL21pQE81L－WspR的培養(yǎng)基加入Amp抗生素，培養(yǎng)菌株BL21pQE81L的培養(yǎng)基加入Amp和Kan抗生素），37℃恒溫搖床中180rpm振蕩培養(yǎng)過夜；取1mL上述菌液接種于50mL LB培養(yǎng)基中，37℃恒溫搖床中180rpm振蕩培養(yǎng)4～6h，至 OD600值為0.4～0.6左右，停止培養(yǎng)；在超菌臺上往培養(yǎng)基中加入0.1M的IPTG 250μL（最終濃度為0.5M）誘導(dǎo)，28℃搖床，180 rpm培養(yǎng)4h.

把上述誘導(dǎo)好的菌液分別用兩個50mL的離心管平均分裝成兩管（每管25mL），高速離心機4℃，12 000rpm離心15分鐘；倒掉上清液，沉淀用25mL的雙蒸水洗滌一次，4 ℃，12 000 rpm離心10分鐘后，再重復(fù)一次；倒掉上清液，用1mL 10mM Tris－HCl （pH 8.0，含100mM NaCl）溶液進行重懸；向懸浮液中加入25μL的25mg／mL的溶菌酶；將懸浮液用細胞破碎儀破碎細胞（2mm超聲探頭，50%功率）每次3s，間隙3s，30min，使外膜破裂，溶菌酶進入細胞壁；向溶液中加入60%的HClO4，至終濃度為20%，使懸浮液的大分子物質(zhì)沉淀；將懸浮液放置于冰上10min，用約1.5mL 3MKOH（含0.4M Tris和2MKCl）溶液中和至PH＝7.0；再次用高速離心機12 000r／min，4℃離心10min；取上清液，用0.2μm濾膜的細菌過濾器進行過濾，即得到c－di－GMP粗提取品，將濾液用2mL的離心管保存在－80℃冰箱備用.

1.2.5 c－di－GMP的初步檢測

本過程分成對照組和實驗組：對照組加入菌株BL21pQE81Lc－di－GMP的粗提取物，實驗組加菌 株 BL21pQE81L－WspR 的 c－di－GMP 粗提物.

取四個無菌2.5mL的離心管，其中兩管里加入23ul的pQE81L，另外兩管兩管里加入23 μL的pQE81L－WspR，然后往四個離心管里各加入50mM Tris－HCl（pH 8.0，含100mM KCl）550μL，血紅素32.6μL混勻，放入水浴鍋中加熱至95℃，并保持5min；冷卻上述混合液至常溫，保持15min，分別往四個離心管里加入2.6 μL的吖啶黃，放入4 ℃冰箱12h；從冰箱里取出，分別往里面加入109.8μL ABTS，并放入16℃冰箱15min；然后加入5μL的30%的過氧化氫混勻，觀察各管內(nèi)顏色變化，即可檢測出c－di－GMP合成酶基因WspR在大腸桿菌中的表達情況.

2 結(jié)果與分析

2.1 質(zhì)粒pQE81L－WspR的構(gòu)建

將質(zhì)粒載體pQE81L和目的基因片段WspR進行雙酶切，然后用T4DNA連接酶將載體和目的基因片段連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21（DE3）得到重組質(zhì)粒，如圖1所示.

圖1 pQE81L－WspR質(zhì)粒構(gòu)建流程Fig.1 The process of building plasmid pQE81L－WspR

2.2 PCR擴增檢測攜帶pQE81L－WspR的陽性轉(zhuǎn)化子

轉(zhuǎn)入大腸桿菌中的質(zhì)粒pQE81L－WspR，經(jīng)菌落PCR擴增檢測呈陽性的克隆提取質(zhì)粒進行PCR鑒定，1%瓊脂糖凝膠電泳檢測圖譜中呈現(xiàn)588bp左右的目的基因條帶，與預(yù)期結(jié)果一致，說明大腸桿菌BL21PQE81L已攜帶WspR的陽性轉(zhuǎn)化子，如圖2所示.

圖2 pQE81L－WspR的鑒定Fig.2 The identification of pQE81L－WspR

2.3 蛋白表達結(jié)果

通過SDS－PAGE凝膠電泳，可以初步確定蛋白表達圖譜上增加了一條40kD左右的條帶，為WspR蛋白，如圖3所示.

圖3 pQE81L－WspR在E.coli BL21菌株中的表達Fig.3 The expression of pQE81L－WspR in E.coli

2.4 c－di－GMP存在性檢測

根據(jù) c－di－GMP的檢測步驟，當(dāng)加入血紅素時，pQE81L系列為無色，pQE81L－WspR系列為淺淺的紅綠色，如圖4所示；再加入吖啶黃時，pQE81L系列為淺淺的黃色，pQE81L－WspR系列為深黃色，如圖5所示；所有藥品加完時pQE81L系列為淺綠色，pQE81L－WspR系列為深綠色，如圖6所示.

上述實驗經(jīng)多次反復(fù)操作，顏色變化保持一致，表明大腸桿菌BL21pQE81L－WspR參與合成了 c－di－GMP，并且c－di－GMP氧化ABTS 為ABTS＋離子，是整個溶液表現(xiàn)出ABTS＋離子的顏色，即綠色.而大腸桿菌BL21pQE81L雖然也合成了c－di－GMP，使溶液表現(xiàn)淡淡的淺綠色，但相比WspR基因存在下合成的量卻很少.

綜上所述，WspR受體蛋白能促進大腸桿菌合成第二信使c－di－GMP，并且大大加速了c－di－GMP的合成量.

圖4 加入血紅素后的顏色變化Fig.4 The colour change after adding hemin

圖5 加入吖啶黃后的顏色變化 Fig.5 The colour change after adding acriflavine

圖6 加完ABTS和H2O2之后的顏色變化 Fig.6 The colour change after adding ABTS and H2O2

3 討 論

作為一個廣泛存在的第二信使－環(huán)二鳥苷酸（c－di－GMP），國內(nèi)外在有關(guān)代謝調(diào)控、細胞功能和信號傳導(dǎo)的作用等方面取得了重要的進展［19－23］.但是目前對土壤農(nóng)桿菌 ATCC31749中c－di－GMP的調(diào)控機制目前還不清楚，而我們通過研究驗證WspR能在大腸桿菌中表達，并促進cdi－GMP大量表達，這為下一步研究 WspR在土壤農(nóng)桿菌ATCC31749中促進c－di－GMP合成提供基礎(chǔ)，進而為可得膠合成提供一定的依據(jù).

雖然我們初步證實了WspR受體蛋白能在大腸桿菌中促進c－di－GMP大量表達，但相關(guān)研究還有許多問題尚待解決：①合成c－di－GMP的影響因素、最佳條件、調(diào)控機制；②WspR能否在土壤農(nóng)桿菌ATCC31749中合成c－di－GMP并表達大量的胞外多糖可得膠；③尋找菌體內(nèi)c－di－GMP作用的靶點，但是還有許多細菌并不含有GEMM RNA，那么這些細菌中c－di－GMP第二信使傳導(dǎo)通路是否存在其他調(diào)節(jié)機制有待于進一步研究.未來的研究中，鑒定新的c－di－GMP調(diào)控是我們迫切需要解決的問題.

4 結(jié) 論

綠膿桿菌中得到的類趨化系統(tǒng)蛋白 WspR在大腸桿菌BL21中順利促進合成c－di－GMP，并且合成量能大大增加.而大腸桿菌是大量高效表達純化蛋白質(zhì)的模式菌株，這就為后期研究WspR受體蛋白在土壤農(nóng)桿菌ATCC31749中促進合成c－di－GMP，進而合成胞外多糖可得膠提供了確切可行的依據(jù).

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