孫圣凱，陳旭義，湯鋒武，張西正，李瑞欣，郭 勇，侍才洪，程 韜

0 引言

神經(jīng)干細(xì)胞的發(fā)現(xiàn)和研究為神經(jīng)再生這一難題提供了新的契機(jī)。目前，關(guān)于神經(jīng)干細(xì)胞的增殖與定向分化中存在著如分化細(xì)胞不能夠獲得成熟神經(jīng)元的全部特征、分化存活率低及分化不確定等問題[1-2]?？偨Y(jié)當(dāng)前力學(xué)載荷對(duì)神經(jīng)干細(xì)胞的影響，從胚胎發(fā)育學(xué)及神經(jīng)干細(xì)胞生長的微環(huán)境角度考慮，我們認(rèn)為脈沖載荷可能是影響神經(jīng)干細(xì)胞生長、發(fā)育、增殖、遷移及分化的合適力學(xué)環(huán)境，可能誘導(dǎo)出相對(duì)成熟的神經(jīng)元樣細(xì)胞，并影響其有序排列及定向遷移。本課題組設(shè)計(jì)并建立了一套新型的動(dòng)態(tài)脈沖載荷與灌流生物反應(yīng)器系統(tǒng)。該生物反應(yīng)器能模擬體內(nèi)生物學(xué)及力學(xué)環(huán)境，對(duì)培養(yǎng)神經(jīng)干細(xì)胞進(jìn)行穩(wěn)定及可靠的脈沖載荷及應(yīng)變刺激，為動(dòng)態(tài)培養(yǎng)環(huán)境下神經(jīng)干細(xì)胞遷移、定向誘導(dǎo)、分化及力學(xué)生物學(xué)機(jī)理研究提供了一種可靠的平臺(tái)。

1 材料與方法

1．1 動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)側(cè)腦室顱內(nèi)壓變化及生化指標(biāo)

選取武警后勤學(xué)院附屬醫(yī)院神經(jīng)科重癥監(jiān)護(hù)病房（Neuro-ICU）在2010年6月至2011年6月期間收治的蛛網(wǎng)膜下腔出血（subarachnoid hemorrhage，SAH）Hunt-hess分級(jí)Ⅰ～Ⅲ患者36例。在積極治療原發(fā)病的基礎(chǔ)上，均予以急診行錐顱側(cè)腦室額角穿刺術(shù)。具體方法為：患者剃發(fā)，消毒，鋪無菌巾，取鼻根正中間向上12～13 cm，旁開2.5～3.5 cm為穿刺點(diǎn)（如圖1所示）。右手持針，針尖與皮膚垂直，向同側(cè)外眥角方向直刺約4～5 cm，拔出針芯，如有腦脊液流出，連接RAUMDIC雙腔腦室引流裝置（內(nèi)徑1.8mm的內(nèi)腔管，外徑2mm，德國羅牌）。術(shù)后予以持續(xù)腦室外引流及顱內(nèi)壓監(jiān)護(hù)，引流管保留時(shí)間為5～7 d。分別于腦室引流術(shù)后 1、3、5、7 d 送檢腦脊液，比較腦脊液細(xì)胞及生化指標(biāo)。

圖1 側(cè)腦室穿刺示意圖

1.2 動(dòng)態(tài)載荷與脈沖生物反應(yīng)器系統(tǒng)的設(shè)計(jì)

1．2．1 脈沖力學(xué)加載裝置結(jié)構(gòu)

脈沖力學(xué)加載裝置包括電動(dòng)機(jī)動(dòng)力系統(tǒng)、細(xì)胞加載系統(tǒng)和計(jì)算機(jī)控制系統(tǒng)。細(xì)胞力學(xué)加載生物反應(yīng)器在單片機(jī)程序及電路控制系統(tǒng)調(diào)控下可以對(duì)培養(yǎng)皿內(nèi)的細(xì)胞進(jìn)行生物學(xué)培養(yǎng)，同時(shí)又可以對(duì)細(xì)胞施加一定參數(shù)的脈沖力學(xué)載荷。其結(jié)構(gòu)如圖2所示。步進(jìn)電動(dòng)機(jī)通過行程連桿能夠進(jìn)行一定程序控制下的正轉(zhuǎn)和反轉(zhuǎn)，帶動(dòng)移動(dòng)夾持塊作往復(fù)運(yùn)動(dòng)，通過注射器傳遞液體壓力，進(jìn)而對(duì)培養(yǎng)在生物半透膜上的神經(jīng)細(xì)胞形成液壓沖擊（如圖3所示）；培養(yǎng)皿內(nèi)設(shè)置壓力傳感器及血?dú)夥治鎏筋^，監(jiān)測(cè)培養(yǎng)皿內(nèi)生物學(xué)指標(biāo)（如溫度、pO2、pCO2及pH值）及液壓傳遞變化。數(shù)據(jù)采集與計(jì)算機(jī)相連，進(jìn)行實(shí)時(shí)調(diào)控。

圖2 細(xì)胞脈沖力學(xué)加載裝置結(jié)構(gòu)圖

圖3 細(xì)胞脈壓加載示意圖

1．2．2 電路控制與動(dòng)力系統(tǒng)的設(shè)計(jì)及工作原理

步進(jìn)電動(dòng)機(jī)為42BYG001（江蘇金壇市四海電機(jī)廠），分辨率為 0.6°/步，控制精度為 0.001 25mm，螺距為0.5mm，實(shí)際誤差控制為±50με。驅(qū)動(dòng)器采用SH-4012伺服器，其與步進(jìn)電動(dòng)機(jī)連接，通過計(jì)算機(jī)EPP進(jìn)行連接后構(gòu)成動(dòng)力加載系統(tǒng)。通過編碼的單片機(jī)控制系統(tǒng)調(diào)控步進(jìn)電動(dòng)機(jī)，彩色液晶可視頻顯示載荷參數(shù)并實(shí)時(shí)控制單片機(jī)程序。具體程序設(shè)計(jì)原理如圖4所示。

1．3 生物反應(yīng)器運(yùn)行測(cè)試

以下對(duì)生物反應(yīng)器的穩(wěn)定性、可靠性及精確度進(jìn)行驗(yàn)證，并對(duì)培養(yǎng)系統(tǒng)的密閉性、無菌性及生物學(xué)環(huán)境進(jìn)行測(cè)量。將細(xì)胞培養(yǎng)倉置于含5%（體積分?jǐn)?shù)）CO2、37℃恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)，加入含10%胎牛血清的α-MEM培養(yǎng)液100mL；以5、10及20mL/min的流速實(shí)施循環(huán)灌流；通過控制系統(tǒng)或液晶屏可輸入載荷頻率、加載時(shí)間、實(shí)現(xiàn)波形等參數(shù)，實(shí)時(shí)觀察并記錄各種實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，糾正并調(diào)整與理論數(shù)據(jù)的偏差。每天抽取5mL培養(yǎng)液作細(xì)菌培養(yǎng)，行二氧化碳、氧分壓、pH值及生化指標(biāo)測(cè)量，連續(xù)運(yùn)轉(zhuǎn)15 d。

圖4 應(yīng)變拉伸裝置控制系統(tǒng)程序結(jié)構(gòu)圖

1.4 生物半透膜生物相容性、力學(xué)性能及應(yīng)變測(cè)量

1.4.1 生物半透膜生物相容性測(cè)試

根據(jù) GB/T 16886.5—2003/ISO 10993-5：199《體外細(xì)胞毒性試驗(yàn)》標(biāo)準(zhǔn)，從持續(xù)攪拌的神經(jīng)干細(xì)胞懸浮液中吸取等量的懸浮液，注入與浸提液接觸的生物半透膜，輕輕轉(zhuǎn)動(dòng)培養(yǎng)器皿，使細(xì)胞均勻地分散在生物半透膜表面。選擇含5%（體積分?jǐn)?shù)）CO2的空氣作為緩沖系統(tǒng)，在（37±2）℃溫度下進(jìn)行培養(yǎng)，用顯微鏡檢查培養(yǎng)細(xì)胞的近匯合和形態(tài)情況。同法制備陰性和陽性對(duì)照材料平行器皿。

1.4.2 生物半透膜力學(xué)性能及應(yīng)變測(cè)量

采用硅膠膜（Sylgard 184 kit，USA），自制尺寸：半徑20mm，厚0.3mm。室溫固化7 d后，采用Instron5865材料測(cè)量儀進(jìn)行拉伸實(shí)驗(yàn)。拉伸參數(shù)設(shè)定為：拉伸長度 50mm，拉伸應(yīng)變 3%（3 000με），拉伸速度4.2mm/s，最大拉伸位移0.21 cm，頻率0.5 Hz，拉伸次數(shù)100次。采用Ansys軟件進(jìn)行仿真模擬分析，并構(gòu)建數(shù)據(jù)模型，有限元模型共計(jì)26 322×4=105 288單元，壓力：1、3、7 kPa。采用超彈性單元HYPER58，彈性模量 1.0～17MPa，泊松比 0.45。

1．5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示；正態(tài)分布數(shù)據(jù)采用重復(fù)測(cè)量方差分析，LSD-t檢驗(yàn)方法用于組間多重比較，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 側(cè)腦室顱內(nèi)壓變化及腦脊液生理指標(biāo)

SAH Hunt-hess分級(jí)Ⅰ～Ⅲ患者的顱內(nèi)壓波動(dòng)在5～20mmHg（1mmHg=133.322 Pa），呈半正弦波，頻率為 0.5～2Hz。腦脊液生化：葡萄糖 2.2～3.9mmol/L，蛋白質(zhì)120～600 mg/L，K+（2.73±0.82）mmol/L，Na+（137.7±8.9）mmol/L，Cl-（119.0±10.1）mmol/L。

2．2 設(shè)計(jì)結(jié)果

我們成功研制出在電路控制系統(tǒng)調(diào)控下的動(dòng)態(tài)載荷與脈沖灌流生物反應(yīng)器系統(tǒng)，該裝置可以在培養(yǎng)皿內(nèi)對(duì)細(xì)胞進(jìn)行生物學(xué)培養(yǎng)及誘導(dǎo)，還可以對(duì)細(xì)胞施加一定的脈沖式力學(xué)載荷。實(shí)物圖如圖5、6所示。

圖5 細(xì)胞脈沖力學(xué)加載裝置實(shí)物圖

圖6 細(xì)胞脈沖力學(xué)加載裝置電路控制系統(tǒng)

2．3 生物反應(yīng)器運(yùn)行測(cè)試

反應(yīng)器連續(xù)運(yùn)行15 d，所提取培養(yǎng)基均無細(xì)菌生長。加載裝置能準(zhǔn)確按上位控制指令運(yùn)行，指令工作時(shí)間和頻率與實(shí)際相符，位移偏差為（0.5～8）×10-3mm。在空載運(yùn)行的基礎(chǔ)上，指令參數(shù)設(shè)為0.5Hz、2周、施加應(yīng)變3%，結(jié)果顯示：加載生物反應(yīng)器噪音小、摩擦力小，連接及夾持部位穩(wěn)定，電動(dòng)機(jī)運(yùn)行及升溫穩(wěn)定，硅膠膜彈性良好?？刂葡到y(tǒng)穩(wěn)定，無數(shù)據(jù)紊亂、程序跑飛和暫停現(xiàn)象，液晶顯示屏顯示正常，與實(shí)際運(yùn)行相符。

2．4 生物半透膜生物相容性、力學(xué)性能及應(yīng)變測(cè)量

2.4.1 生物相容性測(cè)量

采用普通聚賴氨酸包被培養(yǎng)器皿和硅膠膜培養(yǎng)神經(jīng)干細(xì)胞，培養(yǎng)5 d后顯微鏡檢查顯示培養(yǎng)細(xì)胞的近匯合和形態(tài)情況如圖7所示。

圖7 nestin免疫熒光染色見陽性克隆球

2.4.2 力學(xué)性能及應(yīng)變測(cè)量

拉伸應(yīng)變?cè)?～3%的范圍內(nèi)，即隨著載荷量的增加，拉伸應(yīng)變也隨之增加，而且這種變化具有良好的量化關(guān)系，如圖8所示。硅膠膜中間部分應(yīng)變較均勻，最大應(yīng)變?yōu)?.082，中間部分為0.024～0.028。

3 討論

在哺乳動(dòng)物中樞神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育過程中，神經(jīng)元細(xì)胞的精確遷移和準(zhǔn)確分化是神經(jīng)系統(tǒng)功能正常實(shí)現(xiàn)的基礎(chǔ)。研究表明，在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中，神經(jīng)干細(xì)胞存在于機(jī)體的特定區(qū)域中，而成體哺乳動(dòng)物腦內(nèi)主要集中于2個(gè)區(qū)域，即側(cè)腦室壁的室下區(qū)和海馬齒狀回的顆粒下區(qū)[3-4]。被神經(jīng)干細(xì)胞占據(jù)的區(qū)域內(nèi)存在了大量的血管內(nèi)皮細(xì)胞，這些內(nèi)皮細(xì)胞從生物學(xué)上調(diào)控了神經(jīng)干細(xì)胞的增殖分化，并且使細(xì)胞始終處于一個(gè)相對(duì)密閉，又不斷地受脈壓作用的力學(xué)環(huán)境中[5]。力學(xué)刺激伴隨著神經(jīng)組織的生長、發(fā)育、功能形成乃至死亡。目前，已證實(shí)力學(xué)環(huán)境對(duì)細(xì)胞增殖、分化及成熟過程具有十分重要的作用[6-9]。因此，力學(xué)刺激等物理因素對(duì)神經(jīng)干細(xì)胞向神經(jīng)細(xì)胞分化和遷移及細(xì)胞間相互作用很可能產(chǎn)生重要的影響。

由于神經(jīng)干細(xì)胞受力的多樣性，研究不同力的作用對(duì)神經(jīng)干細(xì)胞的定向分化是十分復(fù)雜的問題[10]。神經(jīng)干細(xì)胞具有獨(dú)特而復(fù)雜的結(jié)構(gòu)與力學(xué)環(huán)境，包括液體壓力、流體剪應(yīng)力、拉伸力等，因此，在動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)人側(cè)腦室顱內(nèi)壓的基礎(chǔ)上，我們認(rèn)為脈沖力學(xué)載荷是一個(gè)相對(duì)宏觀、綜合的載荷指標(biāo)，有可能是促進(jìn)神經(jīng)干細(xì)胞向神經(jīng)元樣細(xì)胞分化的重要因素。

圖8 硅膠培養(yǎng)細(xì)胞面應(yīng)變與硅膠背面應(yīng)變

該神經(jīng)干細(xì)胞脈沖加載生物反應(yīng)器能較好地模擬體內(nèi)神經(jīng)干細(xì)胞的生理與力學(xué)微環(huán)境。通過電動(dòng)機(jī)控制下的蠕動(dòng)泵作用，不僅使培養(yǎng)液處于相對(duì)高效的傳質(zhì)狀態(tài)，而且能產(chǎn)生不同頻率范圍內(nèi)的半正弦波、正弦波、方波等，使培養(yǎng)的神經(jīng)干細(xì)胞獲得類似側(cè)腦室的力學(xué)激勵(lì)機(jī)制。根據(jù)研究需要可施予不同變量的力學(xué)載荷，進(jìn)而研究各種壓應(yīng)變條件下的細(xì)胞生物學(xué)行為。該細(xì)胞脈沖加載裝置采用步進(jìn)電動(dòng)機(jī)作為動(dòng)力系統(tǒng)來施加載荷，精確度可達(dá)到0.01mm，具有操作簡單、精度高、實(shí)時(shí)記錄跟蹤等特點(diǎn)；另外，通過與計(jì)算機(jī)結(jié)合的數(shù)據(jù)采集卡，可以監(jiān)測(cè)培養(yǎng)液的生化指標(biāo)，保證細(xì)胞培養(yǎng)的生理狀態(tài)，進(jìn)而提高神經(jīng)干細(xì)胞定向誘導(dǎo)及分化的概率。另外，生物硅膠膜的生物相容性良好，具有不易降解、吸收且透明度良好等特點(diǎn)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，采用的生物硅膠膜結(jié)構(gòu)均勻、力學(xué)性能穩(wěn)定，具有良好的載荷及應(yīng)變對(duì)應(yīng)關(guān)系，是比較理想的細(xì)胞基底培養(yǎng)材料。

然而，該細(xì)胞脈沖生物反應(yīng)器所反映出的只是培養(yǎng)膜表觀條件下的表觀微應(yīng)變，而細(xì)胞與細(xì)胞之間的黏附及張力無法直接通過設(shè)備的數(shù)據(jù)顯示出來；而且，模擬的脈沖載荷與實(shí)際載荷仍存在一定差異。因此，在研究神經(jīng)干細(xì)胞遷移、定向誘導(dǎo)、分化及力學(xué)響應(yīng)機(jī)理的基礎(chǔ)上，仍需細(xì)化細(xì)胞與細(xì)胞間的力學(xué)關(guān)系及相互作用，進(jìn)而深入研究神經(jīng)干細(xì)胞的力學(xué)生物學(xué)行為。

4 結(jié)語

該研究設(shè)計(jì)的生物反應(yīng)器能模擬體內(nèi)生物學(xué)及力學(xué)環(huán)境，對(duì)培養(yǎng)神經(jīng)干細(xì)胞進(jìn)行穩(wěn)定、可靠的脈沖載荷及應(yīng)變刺激，有望提高神經(jīng)干細(xì)胞定向誘導(dǎo)為神經(jīng)元樣細(xì)胞的分化率，并為動(dòng)態(tài)培養(yǎng)環(huán)境下神經(jīng)干細(xì)胞遷移、定向誘導(dǎo)、分化及力學(xué)生物學(xué)機(jī)理研究提供一種可靠的平臺(tái)。

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