王 楠，姚學軍，馬立峰，王秀麗，程君生，蔣玉文，趙心力，毛開榮*

(1.中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，北京100081;2.北京市昌平區(qū)動物疫病預防控制中心，北京102200;3.內蒙古動物疫病預防控制中心，呼和浩特010010)

布魯氏菌(Brucella)是一種嚴重威脅人類健康的重要人畜共患病原菌，可感染人、多種家畜和野生動物，引起發(fā)熱、流產與不育、慢性關節(jié)炎及神經損傷等病癥［1］。布魯氏菌病(布病)不但對動物的繁殖和生產性能構成嚴重危害，更重要的是，人感染布魯氏菌后，往往難以治愈，造成嚴重的公共衛(wèi)生問題。近十年來，布病在我國死灰復燃，畜群和人間布病感染率逐年上升［2-5］，再次嚴重地威脅著我國公共衛(wèi)生事業(yè)和畜牧業(yè)發(fā)展。本實驗室建立的補體結合酶聯(lián)免疫吸附試驗方法是一種既保持了補體結合試驗高特異性，又兼具ELISA高敏感性的布魯氏菌病免疫學檢測技術［6］，本實驗室在該方法的基礎上研制了商品化的試劑盒。為了評價布病CF-ELISA試劑盒的敏感性、特異性及其與其他商品化抗體檢測產品的符合率，本試驗對經流行病學調查證實的感染地區(qū)牛、羊群血清，凈化地區(qū)牛、羊血清進行抗體檢測，同時與虎紅平板凝集試驗(RBT)、間接ELISA(iELISA)抗體檢測試劑盒和膠體金檢測試紙條(CGS)進行了敏感性、特異性和產品間的比較分析。

1 材料與方法

1.1 實驗材料 血清樣品為從內蒙古自治區(qū)經流行病學調查證實的感染地區(qū)采集的牛、羊血清各200份，凈化地區(qū)采集牛、羊血清各100份，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

CF-ELISA試劑盒由本實驗室制備(批號:201301)?；⒓t平板凝集試驗抗原(批號:201301)、布病陽性血清(批號:201301)和陰性血清(批號:201202)均由中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所生產制備、鑒定和保存;iELISA試劑盒購自IDEXX公司(批號:p06906);CGS購自韓國 BIONOTE公司(批號:2303038)。

1.2 實驗方法 本實驗為了評價CF-ELISA試劑盒的敏感性，檢測了感染地區(qū)采集的各200份牛、羊血清樣品的布病抗體;為了評價CF-ELISA試劑盒的特異性，檢測了凈化地區(qū)采集的各100份牛、羊血清樣品的布病抗體;同時用其他三種產品對上述血清樣品進行了布病抗體的檢測，將CFELISA試劑盒的檢測結果與其他三種產品進行了比較，上述四種產品的實驗方法如下:

1.2.1 CF-ELISA試劑盒 待檢血清作1∶10稀釋加入到包被好的檢測板中，100 μL/孔，同時設立陽性、陰性和空白對照，室溫孵育30 min。洗滌液250 μL/孔，洗滌4次;加入1∶40稀釋的豚鼠補體，100 μL/孔，室溫孵育30 min。洗滌4次后加入1∶1600稀釋后HRP標記抗豚鼠補體C3抗體，100 μL/孔。室溫孵育30 min。繼續(xù)洗滌4次后，加入底物顯色液，室溫避光顯色10 min;每孔加入終止液50 μL，酶標儀測定450 nm處光吸收值(OD值)。結果判定:試驗成立條件為陽性對照血清OD450nm的平均值應 ＞0.60，陰性對照血清的OD450nm的平均值應＜0.30。樣品的S/P(%)值＝100×(待檢樣品OD450nm值-空白對照OD450nm的平均值)/(陽性對照血清OD450nm的平均值-空白對照OD450nm的平均值)≥0.25，即為陽性。

1.2.2 虎紅平板凝集試驗抗原 按照說明書進行:備一塊潔凈玻璃板，畫成若干個約4 cm2的小格。在方格中滴加被檢血清和布魯氏菌病虎紅平板凝集試驗抗原各一滴(約0.03 mL)，等量混合均勻，在4 min內讀取結果，同時做布病陽性血清和布病陰性血清對照。每份被檢血清在規(guī)定時間內出現(xiàn)肉眼可見凝集反應者判為陽性(+)，不出現(xiàn)凝集反應者為陰性(-)。

1.2.3 iELISA試劑盒 按照說明書進行:待檢牛、羊血清作1∶10倍稀釋加入到包被好的檢測板中，200 μL/孔，同時設立陽性和陰性對照，室溫孵育1 h，洗滌液300 μL/孔，洗滌 3 次;加入 1∶200倍稀釋的酶標抗體，100 μL/孔，室溫孵育30 min，洗滌液300 μL/孔，洗滌3次;加入底物顯色液，室溫避光顯色20 min;每孔加入終止液50 μL，酶標儀測定450 nm處光吸收值(OD值)。結果判定，陽性對照血清OD450nm的平均值應≥0.35，且陽性對照孔OD450nm的平均值/陰性對照孔OD450nm的平均值應≥3.0時，測定結果有效。樣品的S/P(%)值＝100×(樣品OD450nm值-空白對照OD450nm的平均值)/(陽性對照OD450nm的平均值-空白對照OD450nm的平均值)≥120%，即為陽性，否則110% ＜S/P(%)＜120%，為可疑或S/P(%)≤110%為陰性。

1.2.4 膠體金吸附試紙條 按照說明書進行:取1滴血清樣品加入檢測孔中，加入3～4滴樣品稀釋液，10 min后肉眼觀察結果。結果判定，C線處出現(xiàn)紅線時試驗成立，T線處出現(xiàn)紅線時即為陽性，否則為陰性。

1.3 統(tǒng)計方法 采用x2檢驗(McNemar法)統(tǒng)計分析敏感性差異是否顯著。采用Kappa一致性檢驗方法，按照 Landis和 Koch［7］等建立的劃分標準判定一致性。

2 結果

2.1 CF-ELISA試劑盒對感染地區(qū)牛血清樣品抗體檢測結果及與其他產品的敏感性和符合率比較

對200份經流行病學調查證實的感染地區(qū)牛血清樣品，CF-ELISA試劑盒RBT、iELISA試劑盒和CGS檢測結果的比對分析可以得出:CF-ELISA試劑盒相對于RBT、iELISA試劑盒和CGS的敏感性分別為51%、86%和81%。CF-ELISA試劑盒與RBT、iELISA試劑盒和CGS的符合率分別為80%、95%和93%(表1)。

Kappa一致性檢驗分析表明，CF-ELISA試劑盒和iELISA試劑盒檢測結果κ值＞0.81，具有極高度的一致性，CF-ELISA試劑盒和CGS檢測結果κ值＞0.61，具有高度的一致性。各產品間檢測結果的Mc-Nemar檢驗表明，CF-ELISA試劑盒與iELISA試劑盒和CGS的敏感性差異均不顯著(P＞0.05)。

表1 CF-ELISA試劑盒對感染地區(qū)牛血清樣品抗體檢測結果及與其他產品的敏感性和符合率比較

表2 CF-ELISA試劑盒與其他產品比較敏感性和符合率的統(tǒng)計結果

2.2 CF-ELISA試劑盒對凈化地區(qū)牛血清樣品的檢測結果及與其他產品的特異性和符合率比較對100份經流行病學調查證實的凈化地區(qū)牛血清樣品，CF-ELISA試劑盒與RBT、iELISA試劑盒和CGS檢測結果的比對分析可以得出，CF-ELISA試劑盒相對于RBT、iELISA試劑盒和CGS的特異性均為100%。CF-ELISA試劑盒與RBT、iELISA試劑盒和CGS的符合率均為100%(表3)。

表3 CF-ELISA試劑盒對凈化地區(qū)牛血清樣品的檢測結果及與其他產品的特異性和符合率比較

2.3 CF-ELISA試劑盒對感染地區(qū)羊血清樣品的檢測結果及與其他產品的敏感性和符合率比較對200份經流行病學調查證實的感染地區(qū)羊血清樣品，CF-ELISA試劑盒與RBT、iELISA試劑盒和CGS檢測結果的比對分析可以得出，CF-ELISA試劑盒相對于RBT、iELISA試劑盒和CGS的敏感性分別為44%、70%和57%。CF-ELISA試劑盒與RBT、iELISA試劑盒和CGS的符合率分別為80%、89%和85%(表4)。

Kappa一致性檢驗分析表明，CF-ELISA試劑盒和iELISA試劑盒檢測結果κ值＞0.6(表5)，具有高度的一致性。各方法間的McNemar檢驗結果表明，CF-ELISA試劑盒與RBT、iELISA試劑盒、CGS的敏感性和符合率差異均不顯著(P＞0.05)。

2.4 CF-ELISA試劑盒對凈化地區(qū)羊血清樣品的檢測結果及與其他產品的特異性和符合率比較對100份經流行病學調查證實的凈化地區(qū)羊血清樣品，CF-ELISA試劑盒與RBT、iELISA試劑盒和CGS檢測結果的比對分析可以得出，CF-ELISA試劑盒相對于RBT、iELISA試劑盒和膠體金試紙條的特異性均為100%。CF-ELISA試劑盒與 RBT、iELISA試劑盒和CGS的符合率均為100%(表6)。

表4 CF-ELISA試劑盒對感染地區(qū)羊血清樣品的檢測結果及與其他產品的敏感性和符合率比較

表5 CF-ELISA試劑盒與其他產品比較敏感性和符合率的統(tǒng)計結果

表6 CF-ELISA試劑盒對凈化地區(qū)羊血清樣品的檢測結果及與其他產品的特異性和符合率比較

3 討論

3.1 目前我國的布病防治工作，按照畜間布病發(fā)生和流行程度，將全國分為布病重度流行區(qū)、輕度流行區(qū)和凈化區(qū)，對不同流行區(qū)分別采取不同措施管理，并實施分類指導。本實驗通過對感染地區(qū)和凈化地區(qū)分別進行敏感性和特異性的比較分析得出，在感染地區(qū)CF-ELISA試劑盒與iELISA試劑盒和CGS敏感性無顯著差異，在凈化區(qū)CF-ELISA試劑盒與RBT、iELISA試劑盒和CGS特異性也無顯著差異。而且，CF-ELISA方法與作為OIE推薦的國際貿易的iELISA方法之間具有高度的一致性。上述結果表明，CF-ELISA試劑盒是一種可以篩選感染地區(qū)陽性動物，同時也可以監(jiān)測凈化地區(qū)是否有布病感染的快速、高通量血清學檢測方法。

3.2 由于標記抗體的種屬特異性制約了iELISA試劑盒、cELISA試劑盒和CGS等產品只能檢測特定動物的血清，本實驗中采用的商品化試劑盒和試紙條在檢測牛和羊血清時分別使用的是檢測相應血清的兩種試劑盒。CF-ELISA方法特點在于補體參與了抗原抗體反應，針對補體制備的標記抗體無種屬特異性，所以CF-ELISA試劑盒可以同時檢測牛血清和羊血清，而且兩種血清的檢測結果顯示，CF-ELISA試劑盒分別和兩種iELISA試劑盒檢測結果都具有高度的一致性。理論上推測，CFELISA試劑盒同樣可以應用于豬血清、狗血清和其他野生動物的布病抗體檢測，這些有待于進一步的研究證實。

3.3 檢驗醫(yī)學研究工作中，用于評估兩種檢測方法檢測結果是否一致的統(tǒng)計方法很多，例如:x2檢驗、t檢驗和貝葉斯評估法等，事實上這些統(tǒng)計方法都存在局限性和不足，在某些情況下甚至應用不同的統(tǒng)計方法對同一資料進行分析可能得出完全相反的結論。本研究采用x2檢驗中配對計數(shù)資料的McNemar檢驗法分析兩種方法之間檢測結果的差異顯著性;采用Kappa一致性檢驗分析兩種方法之間的一致性，而且根據(jù)參考判斷指標能對一致性分析“量”值化［7，9］，同時應用這兩種統(tǒng)計學方法可以更科學地評價本研究中的產品。當然，實驗中檢測血清的樣本數(shù)量對統(tǒng)計學結果有影響，為了進一步評價CF-ELISA試劑盒的敏感性和特異性，合理擴大檢測樣本的數(shù)量將是下一步的研究重點。

［1］Mehmet Doganay，Bilgehan Aygen.Human brucellosis:an overview［J］.Int J Infect Dis，2003，(7):173-182.

［2］崔步云.中國布魯氏菌病疫情監(jiān)測與控制［J］.疾病監(jiān)測，2007，22(10):649-651.

［3］尚德秋.布魯氏菌病再度肆虐及其原因［J］.中國地方病防治雜志，2001，16(1):29-34.

［4］Mohamed N Seleem，Stephen M Boyle，Nammalwar Sriranganathan.Brucellosis:A re-emerging zoonosis［J］.Veterinary Microbiology，2010，140:392-398.

［5］齊景文.2002-2008年沈陽市畜間布魯氏菌病監(jiān)測分析［J］.中國動物檢疫，2010，27(2):53-54.

［6］毛開榮，王 楠，李文平，等.補體結合酶聯(lián)免疫吸附試驗方法的建立［J］.中國獸藥雜志，2011，45(11):4-8.

［7］Landis J R，Koch G G.The measurement of observer agreement for Gategorical data［J］.Biometrics，1977，33:159-174.

［8］吳泰相，劉關鍵，王家良.醫(yī)學檢驗方法學研究的設計和文獻評價原則［J］.中華檢驗醫(yī)學雜志，2000，6:58-60.

［9］夏邦世，吳金華.Kappa一致性檢驗在檢驗醫(yī)學研究中的應用［J］.中華檢驗醫(yī)學雜志，2006，29(1):83-84.