毛婭卿，王 嘉，吳 濤，王 哲，蔣桃珍

(中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，北京100081)

禽白血病是由禽白血病/肉瘤群病毒引起的禽的多種腫瘤性疾病的總稱［1］。1997和1998年，J亞群禽白血病在世界范圍內(nèi)爆發(fā)，給養(yǎng)禽業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟損失［2-3］。目前該病尚無徹底可行的防治措施，主要是通過病原檢測淘汰陽性雞以凈化種群［4-5］。

禽白血病病毒的主要結(jié)構(gòu)蛋白包括核心蛋白(gag)、酶蛋白(pol)和囊膜蛋白(env)。核心蛋白中的p27蛋白分子量為27 kD，為主要的群特異性抗原［6］。在禽白血病/肉瘤群病毒的檢測試驗中，均以p27作為抗原制備群特異性抗體，從而建立相應的病毒檢測方法［7-8］。本實驗室前期利用電泳方法提取p27蛋白，制備兔抗p27多克隆抗體，并成功研制了禽白血病病毒 ELISA抗原檢測試劑盒［9］。但此方法分離提取的p27蛋白，產(chǎn)量少，成本較高，不利于該試劑盒的商品化生產(chǎn)與應用，目前該試劑盒為實驗室生產(chǎn)。因此我們在前期實驗室工作的基礎上，擬利用大腸桿菌表達p27蛋白并制備兔抗p27多抗，從而建立成熟穩(wěn)定適合于規(guī)?；a(chǎn)的p27蛋白及兔抗p27多抗的生產(chǎn)和純化工藝。

1 材料與方法

1.1 病毒和酶標抗體 禽白血病病毒(RAV-1株、RAV-2株)由中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所供。辣根過氧化物酶標記的兔抗p27抗體由本實驗室制備。

1.2 實驗動物 SPF雞胚和4月齡新西蘭大耳白兔均購自北京梅里亞維通實驗動物技術(shù)有限公司。

1.3 主要試劑及試劑盒 克隆質(zhì)粒載體pMDl8-T、T4 DNA連接酶、IPTG、RT-PCR 試劑盒，購自大連寶生物工程有限公司;工程菌DH5a、BL21(DE3)、原核表達載體pET-28a(+)由本實驗室保存;RNA提取試劑盒、DNA凝膠回收提取試劑盒購自TIANGEN公司;His TrapTMkit、HiTrap rProtein G HP 購自 GE healthcare公司;弗氏完全佐劑(CFA)、弗氏不完全佐劑(IFA)均為中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所供。

1.4 p27基因的克隆

1.4.1 病毒的增殖 取10日齡SPF雞胚按標準方法制備雞胚成纖維細胞(約106個/mL)，分裝到25 cm2瓶中，8 mL/瓶，置37℃二氧化碳培養(yǎng)箱培養(yǎng)，24 h形成單層后接種RAV-1、RAV-2株毒液(10倍稀釋)0.1 mL，置37℃二氧化碳培養(yǎng)箱21 d。在此期間每隔5～7 d傳代一次，共傳代2次，病毒液于-80℃凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.4.2 病毒總RNA的提取 取經(jīng)ELISA檢測呈陽性的細胞，吸取上清，用RNA提取試劑盒提取病毒總RNA。

1.4.3 引物設計及RT-PCR擴增 根據(jù)GenBank上發(fā)表的 p27序列，設計下列引物:上游引物:5’-GGATCCGCCATG CCTGTAGTGATT-3’，下游引物:5’-GTCGACCTAGGGCTGGATAGCAGAC-3’。用上述引物進行一步法RT-PCR反應，在保持閱讀框架不變的前提下，上游引物引入BamH I酶切位點，下游引物引入SalI酶切位點，反應條件為50℃ 30 min，95℃預變性5 min，然后94℃ 1 min，56℃ 1 min，72℃ 1 min，共30個循環(huán);最后72℃反應10 min。

1.4.4 重組克隆載體pMD-p27的構(gòu)建與鑒定RT-PCR擴增產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳鑒定，并用凝膠回收試劑盒回收PCR產(chǎn)物。將純化的RT-PCR產(chǎn)物與pMD-T載體連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a，送英駿生物技術(shù)有限公司測序。測序結(jié)果的序列拼接、校正和分析使用DNA Club、PrimerPremier5及基于Internet上的BLAST分析軟件。

1.5 重組表達質(zhì)粒的構(gòu)建 將測序正確的重組質(zhì)粒用BamH I和Sal I雙酶切獲得p27基因片斷，表達載體pET-28a(+)也用相同的酶消化，回收并純化。p27基因與雙酶切的表達載體連接，轉(zhuǎn)化到DH5a中，然后用菌液進行PCR和酶切鑒定，得到重組的表達質(zhì)粒pET28a-p27。

1.6 重組p27質(zhì)粒的誘導表達和鑒定 將雙酶切鑒定為陽性的重組質(zhì)粒pET28a-p27轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL2l(DE3)，挑選生長良好的陽性單菌落37℃活化過夜，轉(zhuǎn)接種于LB培養(yǎng)基中37℃培養(yǎng)2～3 h(OD600nm至0.6～0.8)，加入IPTG至終濃度為0.5 mmol/L，30℃誘導表達4 h，4℃ 5000 r/min離心15 min，棄去培養(yǎng)液，收集細菌沉淀。將收取的菌體用pH 7.4的PBS離心洗滌3次，懸于10 mmol/L Tris-HCl(pH 8.0)溶液，超聲破菌，4℃12000 r/min離心10 min收集上清。離心沉淀再次用PBS重懸，上清和沉淀分別進行SDS-PAGE檢測。

1.7 p27蛋白在大腸桿菌中的大量表達與純化將上述陽性菌液轉(zhuǎn)接5 mL于500 mL的LB培養(yǎng)基中低溫誘導表達，收集菌體超聲破碎后上清利用金屬螯合柱進行純化、洗脫、收集蛋白，進行SDSPAGE分析。

1.8 兔抗p27蛋白多克隆抗體的制備、ELISA和SDS-PAGE檢測

1.8.1 兔抗p27血清的制備 將純化的p27蛋白溶液與弗氏完全佐劑以1∶1混合乳化后，對試驗兔進行背部多點皮內(nèi)注射免疫。兩周后再用純化的p27蛋白溶液與弗氏不完全佐劑以1∶1混合乳化后，對試驗兔進行背部多點皮下及肌肉注射免疫。二免后兩周再以同樣的方法進行第三次免疫。三次免疫不同時間后經(jīng)耳緣靜脈采血分離血清，然后用純化后的p27蛋白檢測血清抗體效價。血清效價滿足試驗要求即可采血分離血清。

1.8.2 多克隆抗體的純化 采集的兔抗p27抗血清利用HiTrap rProtein G HP(GE)進行純化、洗脫、收集蛋白，并進行SDS-PAGE分析。

2 結(jié)果

2.1 RT-PCR擴增結(jié)果 RT-PCR產(chǎn)物經(jīng)1%的瓊脂糖凝膠電泳，擴增的片段約為740 bp(圖1)，與預期大小相符。

圖1 p27基因的RT-PCR擴增

2.2 重組克隆載體pMD-p27的構(gòu)建與鑒定 將擴增片段克隆到pMD-18T載體，經(jīng)BamH I/Sal I雙酶切，消化得2650 bp和740 bp的片段(圖2)，與預期結(jié)果相符，將重組質(zhì)粒命名為pMD-p27。

圖2 重組克隆載體pMD-p27的酶切鑒定

2.3 重組表達質(zhì)粒(pET28a-p27)的雙酶切鑒定 重組質(zhì)粒(pET28a-p27)經(jīng)BamH I及Sal I雙酶切后，電泳可見到兩條大小分別為5369 bp和740 bp的條帶(圖3)，與預期結(jié)果相符。

圖3 重組表達載體pET28a-p27的酶切鑒定

2.4 p27蛋白在大腸桿菌中的誘導表達 將酶切鑒定為陽性的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入BL21(DE3)，挑取陽性克隆接種LB培養(yǎng)基中，IPTG 30℃誘導表達4 h，菌體處理后進行SDS-PAGE分析，約在27 kD處有1條明顯的誘導蛋白條帶。結(jié)果說明目的蛋白主要以可溶性蛋白的形式在大腸桿菌細胞內(nèi)表達(圖4)。

圖4 融合蛋白在大腸桿菌中的誘導表達

2.5 表達蛋白的Western blot鑒定 Western印跡分析表明，在誘導上清中出現(xiàn)約27 kD的反應帶(圖5)，與融合蛋白的分子量大小基本一致，表明已經(jīng)成功表達p27蛋白。

2.6 表達蛋白的純化 重組表達質(zhì)粒pET28a-p27上含有6個組氨酸，利用鎳離子金屬螯和柱純化大腸桿菌表達的6 His-p27融合蛋白，用不同濃度的咪唑進行洗脫，SDS-PAGE結(jié)果表明獲得了理想的純化產(chǎn)物(圖6)。

圖5 表達產(chǎn)物的Western blot分析

圖6 表達蛋白的純化

2.7 兔抗p27蛋白抗體的效價測定 以p27蛋白免疫前的兔血清做對照，用ELISA法測定抗體效價?？贵w效價為大于最高OD值的50%所對應的血清稀釋度。結(jié)果顯示，二免后1周兩只兔子的血清效價均達1∶12800(表1);三免后1周兩只兔子的血清效價均達1∶25600(表2)。

2.8 兔抗p27蛋白抗體的純化 采集的兔抗p27血清利用HiTrap rProtein G HP(GE)進行純化、洗脫、收集蛋白，并進行SDS-PAGE分析，結(jié)果為單一條帶(圖7)，表明所采用的柱層析方法適合于兔血清IgG的純化。

圖7 兔抗P27抗體的SDS-PAGE分析

表1 二免后1周ELISA檢測血清OD值

表2 三免后1周ELISA檢測血清OD值

3 討論

禽白血病病毒其核心蛋白中的p27蛋白是主要的群特異性抗原，對于禽白血病的診斷有重要的意義。本實驗室前期將大量的ALV細胞培養(yǎng)液經(jīng)超速離心濃縮和純化后，首次在國內(nèi)通過電泳分離法制備了高純度、具有較好的抗原活性的p27蛋白，并成功制備兔抗p27抗體，但是由于禽白血病病毒在細胞上增殖滴度低，獲取大量的病毒液比較的費時費力，不利于規(guī)?；a(chǎn)p27蛋白。利用大腸桿菌表達目的蛋白具有成本低、周期短，操作簡便，表達蛋白可大量生產(chǎn)、易于純化等諸多優(yōu)點，因而普遍為人們所采用。因此，我們克隆了禽白血病病毒p27基因，成功構(gòu)建pET28a-p27重組質(zhì)粒，該質(zhì)粒在大腸桿菌BL21中經(jīng)IPTG誘導后高效的表達目的蛋白。雖然其質(zhì)粒上帶有組氨酸標簽，但由于其分子量小，生理條件下不帶電荷，而且免疫原性較差，在體內(nèi)不易產(chǎn)生抗體，試驗結(jié)果表明該標簽對目的蛋白的結(jié)構(gòu)與功能影響很小。由于目的蛋白帶有組氨酸標簽，使蛋白的純化工藝簡單，容易滿足目的蛋白的大規(guī)模純化。

大腸桿菌表達ALV的p27重組蛋白具有良好的免疫原性，免疫家兔后可產(chǎn)生高效價的抗p27血清，ELISA效價達1∶25600，這與電泳純化病毒p27蛋白免疫家兔所產(chǎn)生的抗體效價基本一致。因此采用大腸桿菌表達p27蛋白制備抗體，為后續(xù)研制禽白血病病毒ELISA檢測試劑盒奠定了基礎。

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